L'ecografia funzionale è una nuova modalità di neuroimaging che consente la mappatura del volume del sangue cerebrale nel cervello dei roditori viventi. Utilizzando l'imaging a onde piane ultra veloci, possiamo misurare le risposte emodinamiche dell'intero cervello con una risoluzione e una sensibilità temporanee speciali senza pari. Questo protocollo spiega come eseguire l'imaging ecografico funzionale transcraniale nei topi, sia per esperimenti su animali anestetizzati che svegli.
Rispetto ad altre tecniche di imaging funzionale dell'intero cervello come FMRI, l'ecografia funzionale offre un'elevata portabilità, facilità d'uso e consente esperimenti in soggetti svegli e in movimento libero, evitando pregiudizi di anestesia e consentendo studi comportamentali. Fino a poco tempo fa, l'imaging FUS veniva utilizzato solo in collaborazione con esperti di ultrasuoni. Ora, questa tecnologia è disponibile per l'ampia comunità delle neuroscienze, grazie a scanner disponibili in commercio e software dedicato per l'imaging cerebrale preclinico, rendendo FUS abbastanza facile da usare senza alcun background negli ultrasuoni.
Per una sessione di imaging anestetizzato, applicare un unguento oculare agli occhi del topo per evitare danni alla cornea e radere la testa del topo usando un tremore. Applicare un po' di crema depilatoria e risciacquare dopo un paio di minuti. Ripeti questo fino a quando i capelli non sono completamente rimossi.
Inserire perni sottocutanei negli arti per la registrazione dell'elettrocardiogramma e posizionare gel ad ultrasuoni centrifugato sulla testa. Per gli esperimenti sui topi svegli, è necessario un intervento chirurgico preliminare per la fissazione della testa. Posizionare il mouse anestetizzato e una cornice stereotassica su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius.
Applicare gel protettivo per gli occhi e somministrare per via sottocutanea lidocaina sotto il cuoio capelluto utilizzando un ago calibro 26, quindi attendere alcuni minuti. Fai un'incisione seguendo la sutura sagittale da dietro l'osso occipitale fino all'inizio dell'osso nasale, quindi usa le forbici chirurgiche per asportare la pelle su entrambi gli emisferi. Pulire il cranio con una soluzione di iodio all'uno per cento e rimuovere il periosteo rimanente.
Usando la piastra della testa come modello, segna due fori nel cranio per posizionare le viti di ancoraggio. Posizionare la piastra di testa con le viti e utilizzare cemento dentale per fissare le viti e la piastra di testa nella parte anteriore e posteriore del telaio per mantenere una buona presa dell'impianto. Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico dopo che il cemento è asciutto e invertire l'anestesia tramite iniezione sottocutanea di un milligrammo per chilogrammo di atipamezolo.
Somministrare meloxicam profilattico per il dolore post-operatorio. Posiziona un cappuccio magnetico stampato in 3D sopra la piastra della testa per la protezione e consenti al mouse di recuperare da quattro a sei giorni prima dell'inizio dell'assuefazione alla gabbia della casa mobile. Metti l'animale in una gabbia di recupero su una piastra riscaldante per alcune ore, quindi riporta il topo nella sua gabbia di casa con i compagni di lettiera.
Il quarto e il quinto giorno dopo il recupero, blocca ripetutamente il mouse alla gabbia della casa mobile e aumenta gradualmente il tempo fisso della testa, a partire da cinque minuti e fino a 30 minuti. Applicare un po 'di gel salino ed ultrasuoni alla finestra di imaging per abituare il mouse. Ripeti questo processo il sesto giorno dopo il recupero.
Avviare il software e creare una sessione di esperimento. Vai al menu sposta sonda per regolare la posizione della sonda a ultrasuoni utilizzando la tastiera di navigazione. Avviare l'acquisizione live view e regolare la posizione della sonda, se necessario, tramite l'imaging in tempo reale del volume di sangue cerebrale animale o CBV.
Allinea il cervello al centro dell'immagine, quindi ottimizza i parametri di imaging per catturare il più alto rapporto segnale/rumore. Aprire l'opzione Angio 3D del software di acquisizione. Sul pannello preimpostato, regolare la prima fetta, l'ultima fetta e i parametri di scansione delle dimensioni del passo per scansionare l'intero cervello e avviare l'acquisizione.
Lasciare aperto il software di acquisizione e avviare il software per l'analisi e la visualizzazione dei dati, quindi caricare la scansione Angio 3D. Naviga attraverso il volume di acquisizione utilizzando il pannello delle tre viste e seleziona la direzione di scansione coronale, l'anteroposteriore o la posturale anteriore. Vai al pannello di registrazione del cervello e carica il modello di riferimento del mouse per il processo di registrazione.
Registrare la scansione su Allen Mouse Common Coordinates Framework utilizzando la modalità di registrazione completamente automatica o manuale. Controllare il risultato osservando la sovrapposizione della scansione Angio 3D e del modello di riferimento, oppure osservando la sovrapposizione della scansione e dell'Atlante di riferimento Allen utilizzando il pannello Atlas manager. Salvare la registrazione come file BPS.
Nel software di studio ICO, assicurarsi che la scansione angiografica e il relativo file BPS siano caricati. Vai al pannello di navigazione del cervello. Nel pannello Atlas Manager, navigate attraverso il mouse Allen Brain Atlas con il navigatore dell'albero figlio padre.
Trova le regioni anatomiche mirate e selezionale per sovrapporle alla scansione nelle tre viste. Visualizzate le regioni di destinazione nel pannello a tre visualizzazione e scegliete un piano di imaging che si sovrapponga alle regioni di destinazione per l'esperimento impostando manualmente due marcatori sulla posizione coronale che include la regione di interesse. Fare clic su Brain Positioning System, o BPS, per estrarre le coordinate motorie risultanti che corrispondono alla posizione della sonda per immaginare il piano di destinazione.
Controllare l'anteprima dell'immagine che viene calcolata dall'angio scansione. Nel software di scansione ICO, accedere al pannello di posizionamento della sonda e fare clic su Inserisci coordinate BPS, quindi applicare le coordinate estratte, facendo sì che la sonda si muova e si allinei sul piano di imaging di destinazione. Eseguire un'acquisizione live view e verificare che il piano di imaging corrente corrisponda alla previsione.
Predefinire la sequenza di stimolazione, incluso il tempo di stimolazione, il tempo di stimolazione dell'interesse e il numero di ripetizioni. Esegui una sequenza FUS 3D definendo il tempo totale di acquisizione, il numero di posizioni e il tempo morto tra le posizioni. Per la stimolazione automatica sincronizzata con il sistema di acquisizione tramite ingresso TTL, selezionare l'opzione trig in prima di iniziare l'acquisizione.
Apri l'acquisizione nel software ICO studio e accedi al menu della mappa di attivazione, quindi compila il campo del modello di attivazione con un orario di inizio e fine e calcola la mappa di attivazione. Regolare i parametri di visualizzazione per la visualizzazione ed esportare la mappa di attivazione come file H5 per l'analisi offline. Esegui una sequenza FUS 3D definendo il tempo totale di acquisizione, il numero di posizioni del piano di imaging e il tempo morto tra le posizioni.
Salva l'acquisizione e caricala nel software di studio ICO. Se necessario, caricare il file BPS e Allen Mouse Brain Coordination Framework. In Atlas Manager, selezionare le aree dell'Atlante come aree di interesse.
Accedere al menu della conducibilità funzionale e selezionare le regioni desiderate e il ROI manager. Visualizza i risultati come matrice di connettività o mappa di correlazione basata su seed, quindi seleziona e regola i filtri della larghezza di banda come desiderato ed esporta i risultati di correlazione per l'analisi statistica. Questo protocollo è stato utilizzato per la quantificazione 3D delle variazioni emodinamiche cerebrali transcranici nel cervello del topo.
La stimolazione dei baffi è stata selezionata come esempio di risposta evocata dalla stimolazione sensoriale. L'attivazione significativa è stata determinata con una risoluzione di un modello lineare generale, o GLM, utilizzando la funzione di risposta emodinamica predefinita del mouse. Il tempo totale di prova è stato di 760 secondi, con una linea di base di 60 secondi, una stimolazione di 80 secondi e un tempo di recupero di 60 secondi ripetuto cinque volte.
Utilizzando un decorso temporale voxel saggio della corteccia somatosensoriale primaria controlaterale, la regione del campo della canna, o S1BF, ha rivelato un aumento dal 15 al 20% del CBV rispetto al basale. Lo stesso paradigma è stato applicato in un topo che si comporta con la testa fissa nella gabbia della casa mobile utilizzando il preset sveglio della scansione ICO. La mappa di attivazione dopo un esperimento di stimolazione multipla dei baffi è mostrata qui.
L'attivazione significativa è stata determinata con la risoluzione di un GLM utilizzando una funzione di risposta emodinamica predefinita del mouse. Le correlazioni temporali che hanno normalizzato le fluttuazioni spontanee cbV a bassa frequenza tra le regioni cerebrali 3D in un topo anestetizzato con ketamina xilazina sono mostrate qui. L'analisi basata sui semi e l'ippocampo dorsale hanno rivelato la significativa conduttività interemisferica tra l'ippocampo destro e sinistro, così come le regioni ippocampali retrò più profonde e le cortesie piriformi.
Una regione di semi selezionata nell'S1BF ha anche prodotto un modello di correlazione simmetrica. Il punto critico per esperimenti di successo è la preparazione animale, in particolare il livello di anestesia per gli esperimenti che coinvolgono animali anestetizzati e la protezione di un cranio negli esperimenti su animali svegli. Se gli Stati Uniti ci hanno permesso di studiare importanti funzioni cerebrali in animali svegli affrontando questioni fondamentali sul sonno, l'apprendimento o il comportamento, ma anche la modulazione farmacologica della connettività funzionale per la scoperta di farmaci.
