Funktioneller Ultraschall ist eine neue Neuroimaging-Modalität, die die Kartierung des zerebralen Blutvolumens im lebenden Nagetiergehirn ermöglicht. Mit ultraschneller flacher Wellenbildgebung können wir hämodynamische Reaktionen des gesamten Gehirns mit unübertroffener spezieller temporärer Auflösung und Empfindlichkeit messen. Dieses Protokoll erklärt, wie transkranielle funktionelle Ultraschallbildgebung bei Mäusen durchgeführt wird, sowohl für betäubte als auch für wache Tierversuche.
Im Vergleich zu anderen funktionellen Bildgebungstechniken des gesamten Gehirns wie FMRI bietet funktioneller Ultraschall eine hohe Portabilität, Benutzerfreundlichkeit und ermöglicht Experimente an wachen und sich frei bewegenden Probanden, wodurch Anästhesieverzerrungen vermieden und Verhaltensstudien ermöglicht werden. Bis vor kurzem wurde die FUS-Bildgebung nur in Zusammenarbeit mit Ultraschallexperten eingesetzt. Jetzt steht diese Technologie der breiten neurowissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung, dank kommerziell erhältlicher Scanner und dedizierter Software für die präklinische Bildgebung des Gehirns, wodurch FUS ohne Ultraschallhintergrund ziemlich einfach zu bedienen ist.
Tragen Sie für eine betäubte Bildgebungssitzung augensalbe auf die Mausaugen auf, um Hornhautschäden zu vermeiden, und rasieren Sie den Mauskopf mit einem Zittern. Tragen Sie etwas Enthaarungscreme auf und spülen Sie sie nach ein paar Minuten aus. Wiederholen Sie dies, bis die Haare vollständig entfernt sind.
Setzen Sie subkutane Stifte in die Gliedmaßen für die Elektrokardiogrammaufzeichnung ein und legen Sie zentrifugiertes Ultraschallgel auf den Kopf. Für wache Mäuseexperimente ist eine vorläufige Operation zur Kopffixierung erforderlich. Legen Sie die betäubte Maus und einen stereotaktischen Rahmen auf ein 37 Grad Celsius heißes Heizkissen.
Tragen Sie ein Schutzgel für die Augen auf und verabreichen Sie Lidocain subkutan mit einer 26-Gauge-Nadel unter die Kopfhaut und warten Sie dann einige Minuten. Machen Sie einen Schnitt nach der sagittalen Naht von hinter dem Hinterhauptbein bis zum Anfang des Nasenbeins und verwenden Sie dann eine chirurgische Schere, um die Haut über beide Hemisphären zu entfernen. Reinigen Sie den Schädel mit einer Prozent Jodlösung und entfernen Sie das verbleibende Periost.
Markieren Sie mit der Kopfplatte als Schablone zwei Löcher im Schädel, um die Verankerungsschrauben zu positionieren. Positionieren Sie die Kopfplatte mit den Schrauben und verwenden Sie Zahnzement, um die Schrauben und die Kopfplatte an der Vorder- und Rückseite des Rahmens zu befestigen, um einen guten Halt des Implantats zu erhalten. Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen, nachdem der Zement getrocknet ist, und kehren Sie die Anästhesie durch subkutane Injektion von einem Milligramm pro Kilogramm Atipamezol um.
Verabreichen Sie prophylaktisches Meloxicam für postoperative Schmerzen. Legen Sie zum Schutz eine magnetische 3D-gedruckte Kappe über die Kopfplatte und lassen Sie die Maus vier bis sechs Tage vor Beginn der Gewöhnung an den Wohnmobilkäfig erholen. Legen Sie das Tier für einige Stunden in einen Aufwachkäfig auf ein Heizkissen und bringen Sie die Maus dann mit Wurfgefährten in ihren Heimkäfig zurück.
Am vierten und fünften Tag nach der Genesung klemmen Sie die Maus wiederholt an den Wohnmobilkäfig und erhöhen Sie allmählich die feste Kopfzeit, beginnend mit fünf Minuten und bis zu 30 Minuten. Tragen Sie etwas Kochsalzlösung und Ultraschallgel auf das Bildgebungsfenster auf, um die Maus zu gewöhnen. Wiederholen Sie diesen Vorgang am sechsten Tag nach der Wiederherstellung.
Starten Sie die Software und erstellen Sie eine Experimentsitzung. Gehen Sie zum Menü Sonde bewegen, um die Position der Ultraschallsonde über die Navigationstastatur anzupassen. Starten Sie die Live-View-Erfassung und passen Sie die Sondenposition bei Bedarf über eine Echtzeitbildgebung des zerebralen Blutvolumens (CBV) des Tieres an.
Richten Sie das Gehirn in der Mitte des Bildes aus und optimieren Sie dann die Bildgebungsparameter, um das höchste Signal-Rausch-Verhältnis zu erfassen. Öffnen Sie die Angio 3D-Option der Erfassungssoftware. Passen Sie im Voreinstellungsbereich die Scanparameter für das erste Slice, das letzte Slice und die Schrittgröße an, um das gesamte Gehirn zu scannen und die Erfassung zu starten.
Lassen Sie die Erfassungssoftware offen und starten Sie die Software zur Datenanalyse und Visualisierung, dann laden Sie den Angio 3D-Scan. Navigieren Sie mit dem Drei-Ansichten-Panel durch das Erfassungsvolumen und wählen Sie die koronale Scanrichtung, anteroposterior oder postural anterior. Gehen Sie zum Gehirnregistrierungsbereich und laden Sie die Mausreferenzvorlage für den Registrierungsprozess.
Registrieren Sie den Scan auf dem Allen Mouse Common Coordinates Framework mit dem vollautomatischen oder manuellen Registrierungsmodus. Überprüfen Sie das Ergebnis, indem Sie sich die Überlagerung des Angio 3D-Scans und der Referenzvorlage oder die Überlagerung des Scans und des Inbus-Referenzatlas mit dem Atlas-Manager-Bedienfeld ansehen. Speichern Sie die Registrierung als BPS-Datei.
Stellen Sie in der ICO Studio-Software sicher, dass der angiographische Scan und seine BPS-Datei geladen sind. Gehen Sie zum Navigationsbereich des Gehirns. Navigieren Sie im Atlas Manager-Bedienfeld mit dem Navigator des übergeordneten untergeordneten Baums durch die Maus Allen Brain Atlas.
Suchen Sie die anatomischen Zielregionen und wählen Sie sie aus, um sie dem Scan in den drei Ansichten zu überlagern. Visualisieren Sie die Zielregionen im Bereich mit den drei Ansichten und wählen Sie eine Abbildungsebene, die die Zielregionen für das Experiment überlappt, indem Sie manuell zwei Marker auf der koronalen Position setzen, die den interessierenden Bereich enthält. Klicken Sie auf Brain Positioning System oder BPS, um die resultierenden motorischen Koordinaten zu extrahieren, die der Sondenposition entsprechen, um die Zielebene abzubilden.
Überprüfen Sie die Vorschau des Bildes, das aus dem Angio-Scan berechnet wird. Geben Sie in der ICO-Scan-Software das Sondenpositionierungsfeld ein und klicken Sie auf BPS-Koordinaten eingeben, und wenden Sie dann die extrahierten Koordinaten an, wodurch sich die Sonde auf der Zielbildgebungsebene bewegt und ausrichtet. Führen Sie eine Live-View-Erfassung durch und überprüfen Sie, ob die aktuelle Abbildungsebene der Vorhersage entspricht.
Definieren Sie die Stimulationssequenz vor, einschließlich des Stimulationszeitpunkts, der Interessestimulationszeit und der Anzahl der Wiederholungen. Führen Sie eine 3D-FUS-Sequenz aus, indem Sie die Gesamterfassungszeit, die Anzahl der Positionen und die Totzeit zwischen den Positionen definieren. Für eine automatische Stimulation, die über den TTL-Eingang mit dem Erfassungssystem synchronisiert ist, wählen Sie die Trig-In-Option, bevor Sie mit der Erfassung beginnen.
Öffnen Sie die Akquisition in der ICO Studio-Software und rufen Sie das Aktivierungskartenmenü auf, füllen Sie dann das Aktivierungsmusterfeld mit Start- und Endzeiten aus und berechnen Sie die Aktivierungszuordnung. Passen Sie die Anzeigeparameter für die Visualisierung an und exportieren Sie die Aktivierungskarte als H5-Datei für die Offline-Analyse. Führen Sie eine 3D-FUS-Sequenz aus, indem Sie die Gesamterfassungszeit, die Anzahl der Positionen der Bildgebungsebene und die Totzeit zwischen den Positionen definieren.
Speichern Sie die Akquisition und laden Sie sie in die ICO Studio Software. Laden Sie bei Bedarf die BPS-Datei und das Allen Mouse Brain Coordination Framework. Wählen Sie im Atlas-Manager Regionen des Atlas als Interessengebiete aus.
Rufen Sie das Menü funktionale Leitfähigkeit auf und wählen Sie die gewünschten Regionen und den ROI-Manager aus. Visualisieren Sie die Ergebnisse als Konnektivitätsmatrix oder Seed-basierte Korrelationskarte, wählen Sie dann die Bandbreitenfilter nach Belieben aus und passen Sie sie an und exportieren Sie die Korrelationsergebnisse für die statistische Analyse. Dieses Protokoll wurde zur 3D-Quantifizierung zerebraler hämodynamischer Variationen transkraniell im Mausgehirn verwendet.
Die Whisker-Stimulation wurde als Beispiel für eine sensorische Stimulation ausgewählt, die eine Reaktion hervorruft. Die signifikante Aktivierung wurde mit einer Auflösung eines allgemeinen linearen Modells (GLM) unter Verwendung der standardmäßigen hämodynamischen Reaktionsfunktion der Maus bestimmt. Die Gesamtversuchszeit betrug 760 Sekunden, wobei eine Baseline von 60 Sekunden, eine Stimulation von 80 Sekunden und eine Fünffach wiederholte Erholungszeit von 60 Sekunden erforderlich waren.
Unter Verwendung eines voxelweisen Zeitverlaufs des kontralateralen primären somatosensorischen Kortex zeigte die Barrel Field Region oder S1BF einen Anstieg des CBV um 15 bis 20% im Vergleich zum Ausgangswert. Das gleiche Paradigma wurde in einer Maus mit festem Kopfverhalten im Mobilheimkäfig angewendet, die die Wachvoreinstellung des ICO-Scans verwendete. Die Aktivierungskarte nach einem Multiple-Whisker-Stimulationsexperiment ist hier dargestellt.
Die signifikante Aktivierung wurde mit der Auflösung eines GLM unter Verwendung einer standardmäßigen hämodynamischen Mausreaktionsfunktion bestimmt. Die zeitlichen Korrelationen haben hier die niederfrequenten spontanen CBV-Fluktuationen zwischen 3D-Hirnregionen in einer Ketamin-Xylazin-anästhesierten Maus normalisiert. Die samenbasierte Analyse und der dorsale Hippocampus zeigten die signifikante interhemisphärische Leitfähigkeit zwischen dem rechten und linken Hippocampus sowie tiefere Retro-Hippocampus-Regionen und piriforme Höflichkeiten.
Eine im S1BF ausgewählte Saatgutregion ergab ebenfalls ein symmetrisches Korrelationsmuster. Der kritische Punkt für erfolgreiche Experimente ist die Tierpräparation, insbesondere der Grad der Anästhesie für Experimente mit betäubten Tieren und der Schutz eines Schädels bei Versuchen an wachen Tieren. If US ermöglichte es uns, wichtige Gehirnfunktionen bei wachen Tieren zu untersuchen, die sich mit grundlegenden Fragen zu Schlaf, Lernen oder Verhalten befassen, aber auch mit der pharmakologischen Modulation der funktionellen Konnektivität für die Wirkstoffforschung.
