Функциональное ультразвуковое исследование — это новый метод нейровизуализации, который позволяет отображать объем мозговой крови в мозге живых грызунов. Используя сверхбыструю плоскую визуализацию волн, мы можем измерить гемодинамические реакции всего мозга с непревзойденным специальным временным разрешением и чувствительностью. Этот протокол объясняет, как выполнять транскраниальную функциональную ультразвуковую визуализацию у мышей, как для экспериментов с анестезией, так и для экспериментов на животных.
По сравнению с другими методами функциональной визуализации всего мозга, такими как FMRI, функциональное ультразвуковое исследование обеспечивает высокую портативность, простоту использования и позволяет проводить эксперименты на бодрствующих и свободно движущихся субъектах, избегая смещения анестезии и позволяя проводить поведенческие исследования. До недавнего времени визуализация FUS использовалась только в сотрудничестве с ультразвуковым экспертом. Теперь эта технология доступна широкому сообществу нейробиологии благодаря коммерчески доступным сканерам и специальному программному обеспечению для доклинической визуализации мозга, что делает FUS довольно простым в использовании без какого-либо фона в ультразвуке.
Для сеанса анестезированной визуализации нанесите глазную мазь на глаза мыши, чтобы избежать повреждения роговицы, и побрейте голову мыши с помощью тремора. Нанесите крем для депиляции и смойте через пару минут. Повторяйте это до тех пор, пока волосы не будут полностью удалены.
Вставьте подкожные штифты в конечности для записи электрокардиограммы и поместите центрифугированный ультразвуковой гель на голову. Для экспериментов с бодрствующими мышами требуется предварительная операция для фиксации головы. Поместите обезболенную мышь и стереотаксическую рамку на грелку с 37 градусами Цельсия.
Нанесите защитный гель на глаза и подкожно введите лидокаин под кожу головы с помощью иглы 26 калибра, затем подождите несколько минут. Сделайте разрез после сагиттального шва из-за затылочной кости до начала носовой кости, затем используйте хирургические ножницы для иссечения кожи над обоими полушариями. Очистите череп однопроцентным раствором йода и удалите оставшуюся часть позвони.
Используя головную пластину в качестве шаблона, отметьте два отверстия в черепе, чтобы расположить анкерные винты. Расположите головную пластину с помощью винтов и используйте зубной цемент для фиксации винтов и головной пластины в передней и задней части рамы, чтобы поддерживать хорошее сцепление имплантата. Удалите животное из стереотаксического каркаса после высыхания цемента и отмените анестезию с помощью подкожной инъекции одного миллиграмма на килограмм атипамезола.
Назначают профилактический мелоксикам при послеоперационных болях. Поместите магнитный 3D-печатный колпачок на головную пластину для защиты и позвольте мыши восстановиться в течение четырех-шести дней до начала привыкания к подвижной домашней клетке. Поместите животное в клетку восстановления на грелку на несколько часов, затем верните мышь в домашнюю клетку с однопометниками.
На четвертый и пятый день после выздоровления многократно прижимают мышь к подвижной домашней клетке и постепенно увеличивают фиксированное время головы, начиная с пяти минут и до 30 минут. Нанесите немного физиологического раствора и ультразвукового геля на окно визуализации, чтобы привыкнуть к мыши. Повторите этот процесс на шестой день после восстановления.
Запустите программное обеспечение и создайте сеанс эксперимента. Перейдите в меню перемещения зонда, чтобы настроить положение ультразвукового зонда с помощью навигационной клавиатуры. Запустите сбор данных в режиме реального времени и при необходимости отрегулируйте положение зонда с помощью визуализации объема мозговой крови животного в режиме реального времени или CBV.
Выровняйте мозг в центре изображения, а затем оптимизируйте параметры изображения, чтобы захватить самое высокое соотношение сигнал/шум. Откройте опцию Angio 3D программного обеспечения для приобретения. На предустановленной панели отрегулируйте параметры сканирования первого среза, последнего среза и размера шага, чтобы отсканировать весь мозг и начать приобретение.
Оставьте программное обеспечение для сбора данных открытым и запустите программное обеспечение для анализа и визуализации данных, а затем загрузите 3D-сканирование Angio. Перемещайтесь по объему сбора с помощью панели из трех видов и выберите направление коронального сканирования, переднезаднее или постуральное переднее. Перейдите на панель регистрации мозга и загрузите шаблон ссылки мыши для процесса регистрации.
Зарегистрируйте сканирование в Allen Mouse Common Coordinates Framework, используя полностью автоматический или ручной режимы регистрации. Проверьте результат, посмотрев на суперпозицию 3D-сканирования Angio и эталонный шаблон или посмотрев на суперпозицию сканирования и справочного атласа Аллена с помощью панели менеджера Atlas. Сохраните регистрацию в виде BPS-файла.
В программном обеспечении студии ICO убедитесь, что ангиографическое сканирование и его BPS-файл загружены. Перейдите на панель навигации мозга. На панели Atlas Manager перемещайтесь по мыши Allen Brain Atlas с помощью навигатора родительского дочернего дерева.
Найдите анатомические целевые области и выберите их, чтобы наложить их на сканирование в трех представлениях. Визуализируйте целевые области на панели «Три вида» и выберите плоскость изображения, которая перекрывает целевые области для эксперимента, вручную установив два маркера в корональной позиции, включающей интересующую область. Нажмите на Систему позиционирования мозга или BPS, чтобы извлечь результирующие координаты двигателя, которые соответствуют положению зонда, чтобы получить изображение целевой плоскости.
Проверьте предварительный просмотр изображения, которое вычисляется из ангиоскан. В программном обеспечении для сканирования ICO войдите в панель позиционирования зонда и нажмите «Введите координаты BPS», затем примените извлеченные координаты, заставляя зонд двигаться и выравниваться на целевой плоскости изображения. Выполните получение изображения в реальном времени и убедитесь, что текущая плоскость изображения соответствует прогнозу.
Предопределите последовательность стимуляции, включая время стимуляции, время стимуляции интереса и количество повторений. Запустите последовательность 3D FUS, определив общее время приобретения, количество позиций и мертвое время между позициями. Для автоматической стимуляции, синхронизированной с системой сбора данных через вход TTL, выберите опцию trig in перед началом сбора.
Откройте приобретение в программном обеспечении ICO studio и войдите в меню карты активации, затем заполните поле шаблона активации временем начала и окончания и вычислите карту активации. Настройте параметры отображения для визуализации и экспортируйте карту активации в виде файла H5 для автономного анализа. Запустите последовательность 3D FUS, определив общее время сбора, количество позиций плоскости изображения и мертвое время между позициями.
Сохраните приобретение и загрузите его в программное обеспечение студии ICO. При необходимости загрузите BPS-файл и координационную структуру мозга мыши Allen Mouse. В диспетчере системы «Атлас» выберите регионы атласа в качестве регионов, представляющих интерес.
Войдите в меню функциональной проводимости и выберите нужные регионы и менеджер ROI. Визуализируйте результаты в виде матрицы связности или корреляционной карты на основе семян, затем выберите и настройте фильтры полосы пропускания по желанию и экспортируйте результаты корреляции для статистического анализа. Этот протокол использовался для 3D-количественной оценки церебральных гемодинамических вариаций транскраниально в мозге мыши.
Стимуляция усов была выбрана в качестве примера сенсорной стимуляции вызванной реакции. Значительную активацию определяли с разрешением общей линейной модели, или GLM, с использованием функции гемодинамического ответа мыши по умолчанию. Общее время испытания составило 760 секунд, с 60-секундным исходным уровнем, 80-секундной стимуляцией и 60-секундным временем восстановления, повторено пять раз.
Используя воксельный мудрый временной ход контралатеральной первичной соматосенсорной коры, области бочкового поля, или S1BF, выявил увеличение CBV на 15-20% по сравнению с исходным уровнем. Та же парадигма была применена к голове неподвижной мыши в клетке мобильного дома с использованием предустановки сканирования ICO. Карта активации после эксперимента с многократной стимуляцией усов показана здесь.
Значительная активация определялась с разрешением GLM с использованием функции гемодинамического ответа мыши по умолчанию. Временные корреляции нормализовали низкочастотные спонтанные флуктуации CBV между 3D-областями мозга у кетаминовой ксилазиновой анестезированной мыши. Анализ семян и дорсального гиппокампа выявил значительную межполушарную проводимость между правым и левым гиппокампом, а также более глубокие ретро-области гиппокампа и грушевидные любезности.
Область семян, выбранная в S1BF, также привела к симметричной корреляционной схеме. Критическим моментом для успешных экспериментов является подготовка животных, в частности уровень анестезии для экспериментов с участием обезболенные животные и защита черепа в экспериментах на бодрствующих животных. Если бы США позволили нам изучить важные функции мозга у бодрствующих животных, имея дело с фундаментальными вопросами сна, обучения или поведения, а также фармакологической модуляцией функциональной связности для открытия лекарств.
