このプロトコルは、材料の知識を持ち、顕微鏡と完全に互換性のある数百のオルガノイドの成長用に設計されたマイクロテクスチャ細胞培養皿を実証します。当社の技術は、数千のオルガノイドを効率的に生成することができ、長期イメージングおよび長期細胞培養と完全に互換性があります。このプロトコルは、薬物スクリーニングパイプラインや癌研究ドメインなどの生物医学的アプリケーションにとって非常に興味深いものです。
このプロトコルで提示されている技術は、実験室の手順と光学顕微鏡検査の経験がある人なら誰でも数回試みた後、簡単に習得できます。まず、PDMSモールドのごく一部を最終デバイスに必要な寸法にカットします。配列のXY方向に平行にカットします。
準備したPDMSモールドダイスの1つを下向きにして、平らなPDMSセクションに置きます。次に、ピペットを使用して、金型の片面に約0.1〜0.2ミリリットルのUV硬化型接着剤を追加します。10倍の倍率で倒立光学顕微鏡を使用して、キャビティ内の液体の進行を追跡します。
接着剤をUV光にさらして硬化させます。テキスト原稿に記載されているように、UV光源のパワー密度に応じて露光時間を調整します。一方の端に過剰量の接着剤を使用して、硬化した接着剤を指で軽く押して平らなPDMS基板上に保持します。
その間、ピンセットを使用して、押さえている同じエッジの隣に金型の片隅をつまみ、テクスチャフィルムが浮き渡らないようにしながら、ゆっくりと金型を剥がします。かみそりの刃を使用して余分な接着剤とPDMS基板をトリミングし、硬化、テクスチャ、および接着剤層をPDMS上に平らにし、余分な基板を片方の端だけにします。きれいなカバーガラスを短い酸素プラズマプロセスで処理して、親水性を向上させます。
プラズマ活性化後、標準的なスピンコーターの真空チャックにカバーガラスを置き、カバーガラスの中央に接着剤を少量注ぐことにより、UV硬化型接着剤の薄層をスピンコートします。テキスト原稿に記載されているようにスピンコーティングプロセスを実行します。スピンコーティングが利用できない場合は、ピペットを使用して、約0.1ミリリットルのUV硬化型接着剤を清潔なカバーガラスに落とします。
2番目のカバーガラスを取り、最初のカバーガラスの上に置き、液体接着剤を2つのカバーガラスの間に均等に広げます。接着剤がカバーガラスの端に達したら、カバーガラスをスライドさせてゆっくりと分離します。分離されると、両方のカバーガラスは液体接着剤の薄層で完全にコーティングされます。
スピンコーティング後、UVにさらして接着剤を予備硬化させます。使用するUV光源のパワー密度に応じて露光時間を調整します。テクスチャフィルムの1つを取り、接着剤でコーティングされたカバーガラスに接触させます。部分的に硬化した接着剤とテクスチャフィルムとの接触ができるだけ均一であることを確認してください。
この段階では、カバーガラスの接着剤は再流を防ぐのに十分なほど固くなければならず、カバーガラスを軽く押すことで接触を最適化できます。コーティングされた接着剤層が完全に硬化するまで、カバーガラスをUV光にさらします。これにより、カバーガラスのテクスチャフィルムがシールされ、周囲の空洞間の漏れ防止の分離が提供されます。
次にピンセットを使用して、トリミング後に余分な材料が残った端でPDMSをつまみ、PDMSフラット基板を剥がします。このステップにより、テクスチャードフィルム層をカバーガラスに接着し、細胞播種のために上部にオープンアクセスすることができます。細胞播種の前に、原稿に記載されているように生体認証コポリマーで不動態化したデバイス上で、1ミリリットルの滅菌PBSを35ミリメートルの細胞培養ペトリ皿に分注します。
真空チャンバーを使用して滅菌PBSで皿を10分間脱気し、続いて数回のピペッティングを行ってすべての気泡を除去します。PBSを滅菌培地と交換し、細胞培養フードの下でプレートをUV光で30分間滅菌します。テキスト原稿に記載されているように、目的の細胞に対するトリプシン処理または細胞懸濁液調製の推奨事項に従って、細胞懸濁液を調製します。
推奨細胞培養培地中の細胞濃度を1ミリリットルあたり500, 000細胞にカウントして調整します。35ミリメートルの細胞培養皿からPBSバッファーを取り出し、調整した細胞懸濁液を1ミリリットル分注します。細胞培養皿を細胞インキュベーターに10分間戻します。
約80〜100個のセルが各周囲空洞に入ります。約10分間のインキュベーション後、インキュベーターから細胞培養皿を回収し、細胞懸濁液を穏やかに吸引して、閉じ込められていない細胞を除去します。1ミリリットルの培地を培養皿に加え、セルインキュベーターに戻します。
必要に応じて、ウェルで成長した後にオルガノイドを回収するには、ピンセットを使用して切断端のテクスチャード接着剤層をつまみ、ガラスカバーガラスからそっと剥がしますが、培地に浸したままにします。生体コポリマーの濃度を上げると、コーティングの厚さが増加しました。細胞培養皿の完全な脱気は、周囲の空洞に閉じ込められた気泡を除去するために不可欠でした。
オルガノイドは、培養の2日目と15日目の後に形成されました。スピニングディスク共焦点顕微鏡は、オルガノイドの代表的な画像と3D再構成を示しました。培養皿を準備するときは、型または基板スタックの組み立てに注意を払い、テクスチャフィルムとカバーガラスの間の良好な接触を確保することが重要です。
私たちの微小空洞によって提供される封じ込めと物質損失の欠如は、オルガノイドの恒常性に対する微小重力の影響を研究することに関心のある宇宙生物学研究者の注目を集めています。
