Die Charakterisierung von 3D-In-vitro-Modellen mit zellulärer und subzellulärer Auflösung ist entscheidend für die vollständige Nutzung, kann aber eine Herausforderung darstellen. Daher haben wir ein komplementäres Protokoll für die Färbung und subzelluläre Bildgebung von fixierten 3D-In-vitro-Modellen im Bereich von 100 Mikrometern bis zu mehreren Millimetern bereitgestellt. 3D-Strukturen sind radial und sollten sorgfältig manipuliert werden.
Überprüfen Sie vor dem Pipettieren die Position Ihrer 3D-Strukturen in der Röhre, um eine Aspiration zu vermeiden. Da wir klassische Techniken für die Einbettung kleiner Strukturen wie Organoide oder Sphäroide adaptiert haben, können visualisierte Anweisungen Erstanwendern helfen, die Aufgabe einfacher zu erledigen. Laura Francols, eine Labortechnikerin der Pathology Research Platform, wird das Verfahren mit mir demonstrieren.
Um Proben für die 3D-Färbung der gesamten Halterung vorzubereiten, verwenden Sie eine mit BSA vorcodierte Pipettenspitze von einem Milliliter, um eine 3D-Struktursuspension von einem Milliliter zu einem 500-Mikroliter-Röhrchen PBS hinzuzufügen. Wenn sich die 3D-Strukturen am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, ersetzen Sie das PBS vorsichtig durch 500 Mikroliter Permeabilisierungsblocklösung für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur mit sanftem horizontalem Rühren bei 30 bis 50 Umdrehungen pro Minute. Lassen Sie die 3D-Strukturen am Ende der Inkubation erneut sedimentieren, bevor Sie die 3D-Strukturen zwei Mal in einem Milliliter von 0,1% PBS, ergänzt mit BSA, für drei Minuten pro Waschgang sorgfältig waschen.
Nach der letzten Wäsche beschriften Sie die 3D-Strukturen mit 250 Mikroliter Primärantikörper in PBS für zwei bis drei Tage unter sanftem horizontalem Rühren bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation wird die Probe mit fünf dreiminütigen und zwei 15-minütigen Wäschen in einem Milliliter von 0,1% PBS BSA pro Waschgang gewaschen. Nach der letzten Wäsche beschriften Sie die 3D-Strukturen mit 250 Mikrolitern des entsprechenden sekundären Antikörpers in PBS für 24 Stunden bei vier Grad Celsius mit sanftem horizontalem Rühren vor Licht geschützt.
Am nächsten Tag beschriften Sie die 3D-Strukturen mit 250 Mikrolitern der entsprechenden Konzentration von Hoechst 3342 für eine zweistündige Inkubation bei vier Grad Celsius mit sanftem horizontalem Rühren. Am Ende der Inkubation waschen Sie die 3D-Strukturen fünfmal für drei Minuten und zweimal für 15 Minuten in einem Milliliter PBS pro Waschgang, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche übertragen Sie die 3D-Strukturen auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte aus schwarzem Polystyrol und geben Sie vorsichtig 200 Mikroliter Reinigungslösung auf die Strukturen, um Blasen zu vermeiden.
Dann legen Sie die mit Alufolie bedeckte Platte bei vier Grad Celsius für mindestens 48 Stunden. Um große 3D-Zellkulturmodelle einzubetten, verwenden Sie eine BSA-beschichtete Pipettenspitze, um die 3D-Strukturen vorsichtig auf ein flaches Glasrohr mit einem mit PTFE ausgekleideten Flaschenverschluss zu übertragen. Nachdem sich die Strukturen abgesetzt haben, ersetzen Sie das PBS vorsichtig durch 70% Ethanol für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das 70%ige Ethanol durch einen Milliliter gebrauchsfertige Eosin-Y-Lösung. Streifen Sie die Tube und färben Sie die Strukturen für mindestens 30 Minuten. Am Ende der Inkubation dehydrieren Sie die Strukturen mit drei aufeinanderfolgenden 30-minütigen Wäschen in einem Milliliter 100% Ethanol pro Waschgang.
Nach der letzten Austrocknung entfernen Sie die 3D-Strukturen mit drei aufeinanderfolgenden 30-minütigen Wäschen in einem Milliliter Xylol pro Waschgang unter einer chemischen Haube. Legen Sie nach dem letzten Eintauchen in Xylol ein Stück Xylol-getränktes Biopsie-Pad in ein Fach einer weißen Mikrotwin-Gewebekassette und verwenden Sie eine BSA-beschichtete Pasteur-Pipette aus Kunststoff mit zwei Millilitern, um die 3D-Strukturen auf das Pad zu übertragen. Decken Sie die 3D-Strukturen mit einem weiteren mit Xylol getränkten Biopsiekissen ab, um die 3D-Strukturen an Ort und Stelle zu halten, und schließen Sie die Kassette.
Wenn alle Proben übertragen wurden, legen Sie die Kassetten für 30 Minuten in ein 65 Grad Celsius Paraffinbad, bevor Sie die Kassetten über Nacht in ein frisches 65 Grad Celsius Paraffinbad legen. Am nächsten Morgen fügen Sie flüssiges Paraffin zu einer 65 Grad Celsius erwärmten Einbettungsform pro Probe hinzu und geben Sie eine in Paraffin eingebettete Probe in jede Form. Rühren Sie die Formen vorsichtig um, bis alle 3D-Strukturen auf den Boden fallen, und verwenden Sie eine 65 Grad Celsius warme feine Pinzette, um die 3D-Strukturen in der Mitte jeder Form zu positionieren.
Kühlen Sie die Form, bis das Paraffin eine dünne feste Schicht bildet, die die 3D-Struktur an Ort und Stelle sichert. Legen Sie eine Taschentuchkassette und geben Sie heißes Paraffin über die Form. Entfernen Sie die Form, wenn das Paraffin vollständig erstarrt ist.
Um kleine 3D-Zellkulturmodelle einzubetten, waschen Sie die 3D-Strukturen vorsichtig dreimal in einem Milliliter TBS pro Waschgang. Entfernen Sie nach dem letzten Waschen so viel TBS wie möglich, ohne die Strukturen zu berühren, und fügen Sie zwei Tropfen Reagenz zwei aus einem handelsüblichen Paraffin-Einbettungskit hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Klopfen und fügen Sie zwei Tropfen Reagenz hinzu, einen mit Klopfen, bis das Gel fest wird.
Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Gel aus der Vertiefung der vormontierten Kassette aus dem Kit zu übertragen, und dehydrieren Sie die in das Gel eingebettete Probe mit 30-minütigen aufsteigenden Ethanol- und Xylol-Inkubationen in einem Abzug wie angegeben. Nach dem letzten Eintauchen in Xylol wird die Kassette über Nacht in ein 65 Grad Celsius Paraffinbad gegeben, bevor die in Paraffin eingebettete Probe mit einer feinen Pinzette in die Mitte einer mit flüssigem Paraffin beladenen 65 Grad Celsius erwärmten Einbettungsform überführt wird. Anschließend sichern Sie die 3D-Struktur mit einer weiteren Schicht Paraffin, wie es für die großen 3D-Zellkulturmodelle gezeigt wird.
Dreidimensionale Whole-Mount-Färbung und konfokale Mikroskopie liefern visuelle Informationen über die zelluläre Zusammensetzung und räumliche Position der 3D-Kulturmodelle bis zu einem Tiefenfeld von bis zu 200 Mikrometern. Die hohe Auflösung, die mit diesem Protokoll für 3D-Strukturen erhalten werden kann, ermöglicht die Anwendung von zellulären und subzellulären Segmentierungsalgorithmen zur Quantifizierung der Zellzahl und zur Detektion verschiedener Zellmarker innerhalb verschiedener Zellsubtypen. Die 3D-Analyse ganzer Halterungen kann auf visualisierte Zellen mit einer Tiefe von bis zu 200 Mikrometern angewendet werden, unabhängig von den gesamten Strukturen.
Im Gegenteil, die 2D-Schnittanalyse kann Einblicke in Zellen jeder Größe liefern.
