La caracterización del modelo 3D in vitro a resolución celular y subcelular es crucial para la explotación completa, pero puede ser un desafío. Por lo tanto, hemos proporcionado un protocolo complementario para la tinción y la resolución subcelular de imágenes de modelos 3D fijos in vitro que van desde 100 micrómetros hasta varios milímetros. Las estructuras 3D son radiales y deben manipularse cuidadosamente.
Antes de pipetear, verifique la ubicación de sus estructuras 3D dentro del tubo para evitar cualquier aspiración. Como hemos adaptado técnicas clásicas para la incrustación de estructuras pequeñas como organoides o esferoides, las instrucciones visualizadas pueden ayudar a los usuarios primerizos a realizar la tarea más fácilmente. Demostrando el procedimiento conmigo estará Laura Francols, una técnica de laboratorio de la Plataforma de Investigación de Patología.
Para preparar muestras para la tinción 3D de montaje completo, use una punta de pipeta de un mililitro precodificada con BSA para agregar una suspensión de estructura 3D de un mililitro a un tubo de 500 microlitros de PBS. Cuando las estructuras 3D se hayan asentado en el fondo del tubo, reemplace cuidadosamente el PBS con 500 microlitros de solución de bloqueo de permeabilización durante una incubación de una hora a temperatura ambiente con agitación horizontal suave a 30 a 50 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, deje que las estructuras 3D sedimenten nuevamente antes de lavar cuidadosamente las estructuras 3D dos veces en un mililitro de 0.1% PBS suplementado con BSA durante tres minutos por lavado.
Después del último lavado, etiquete las estructuras 3D con 250 microlitros de anticuerpos primarios en PBS durante dos o tres días con una suave agitación horizontal a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lavar la muestra con cinco lavados de tres minutos y dos de 15 minutos en un mililitro de BSA al 0,1% de PBS por lavado. Después del último lavado, etiquete las estructuras 3D con 250 microlitros del anticuerpo secundario apropiado en PBS durante 24 horas a cuatro grados centígrados con una suave agitación horizontal protegida de la luz.
Al día siguiente, etiquete las estructuras 3D con 250 microlitros de la concentración apropiada de Hoechst 3342 durante una incubación de dos horas a cuatro grados centígrados con una suave agitación horizontal. Al final de la incubación, lavar las estructuras 3D cinco veces durante tres minutos y dos veces durante 15 minutos en un mililitro de PBS por lavado como se demuestra. Después del último lavado, transfiera las estructuras 3D a una microplaca de poliestireno negro de 96 pocillos y agregue suavemente 200 microlitros de solución de limpieza a las estructuras, evitando burbujas.
Luego coloque la placa cubierta con papel de aluminio a cuatro grados centígrados durante al menos 48 horas. Para incrustar grandes modelos de cultivo celular 3D, use una punta de pipeta de un mililitro recubierta con BSA para transferir cuidadosamente las estructuras 3D a un tubo de vidrio de fondo plano con una tapa de botella forrada de PTFE. Después de que las estructuras se hayan asentado, reemplace cuidadosamente el PBS con etanol al 70% para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, reemplace el etanol al 70% con un mililitro de solución Y de eosina lista para usar. Mueva el tubo y manche las estructuras durante al menos 30 minutos. Al final de la incubación, deshidratar las estructuras con tres lavados sucesivos de 30 minutos en un mililitro de etanol al 100% por lavado.
Después de la última deshidratación, limpie las estructuras 3D con tres lavados sucesivos de 30 minutos en un mililitro de xileno por lavado bajo una campana química. Después de la última inmersión en xileno, coloque un trozo de almohadilla de biopsia empapada en xileno en un compartimento de un casete de tejido microgemelo blanco y use una pipeta Pasteur de plástico de dos mililitros recubierta de BSA para transferir las estructuras 3D a la almohadilla. Cubra las estructuras 3D con otra almohadilla de biopsia empapada en xileno para mantener las estructuras 3D en su lugar y cierre el casete.
Cuando todas las muestras hayan sido transferidas, coloque los casetes en un baño de parafina de 65 grados centígrados durante 30 minutos antes de colocar los casetes en un baño de parafina fresco de 65 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, agregue parafina líquida a un molde de incrustación calentado a 65 grados centígrados por muestra y coloque una muestra incrustada en parafina en cada molde. Agite suavemente los moldes hasta que todas las estructuras 3D caigan al fondo, y use pinzas finas calentadas a 65 grados centígrados para colocar las estructuras 3D en el centro de cada molde.
Enfríe el molde hasta que la parafina forme una capa sólida delgada, asegurando la estructura 3D en su lugar. Coloque un cassette de pañuelo de papel y agregue parafina caliente sobre el molde. Retire el molde cuando la parafina se haya solidificado completamente.
Para incrustar pequeños modelos de cultivo celular 3D, lave suavemente las estructuras 3D tres veces en un mililitro de TBS por lavado. Después del último lavado, retire la mayor cantidad de TBS posible sin tocar las estructuras y agregue dos gotas de reactivo dos de un kit de incrustación de parafina comercial. Mezclar suavemente dando golpecitos, y añadir dos gotas de reactivo una con golpeteo hasta que el gel se solidifique.
Use pinzas finas para transferir el gel del pocillo del casete preensamblado del kit y deshidrate la muestra incrustada en gel con incubaciones ascendentes de etanol y xileno de 30 minutos en una campana extractora, según se indique. Después de la última inmersión en xileno, coloque el casete en un baño de parafina de 65 grados centígrados durante la noche antes de usar pinzas finas para transferir la muestra incrustada en parafina al centro de un molde de parafina líquida cargado a 65 grados centígrados. Luego asegure la estructura 3D con una capa más de parafina como se demostró para los grandes modelos de cultivo celular 3D.
La tinción tridimensional de montaje completo y la microscopía confocal proporcionan información visual sobre la composición celular y la posición espacial de los modelos de cultivo 3D a un campo de profundidad de hasta 200 micras. La alta resolución que se puede obtener para estructuras 3D utilizando este protocolo permite la aplicación de algoritmos de segmentación celular y subcelular para la cuantificación del número celular y la detección de varios marcadores celulares dentro de diferentes subtipos celulares. El análisis de montajes completos 3D se puede aplicar a células visualizadas de hasta 200 micras de profundidad, independientemente de las estructuras completas.
Por el contrario, el análisis de secciones 2D puede proporcionar información sobre celdas de cualquier tamaño.
