La caractérisation d’un modèle 3D in vitro à la résolution cellulaire et subcellulaire est cruciale pour la pleine exploitation, mais peut être difficile. Par conséquent, nous avons fourni un protocole complémentaire pour la coloration et l’imagerie de résolution subcellulaire de modèles 3D in vitro fixes allant de 100 micromètres à plusieurs millimètres. Les structures 3D sont radiales et doivent être manipulées avec soin.
Avant de pipeter, vérifiez l’emplacement de vos structures 3D dans le tube pour éviter toute aspiration. Comme nous avons adapté les techniques classiques pour l’intégration de petites structures telles que les organoïdes ou les sphéroïdes, les instructions visualisées peuvent aider les nouveaux utilisateurs à effectuer la tâche plus facilement. Laura Francols, technicienne de laboratoire de la Plateforme de recherche en pathologie, fera la démonstration de la procédure avec moi.
Pour préparer des échantillons pour la coloration 3D de montage entier, utilisez une pointe de pipette d’un millilitre pré-codée avec BSA pour ajouter une suspension de structure 3D d’un millilitre à un tube de 500 microlitres de PBS. Lorsque les structures 3D se sont installées au fond du tube, remplacez soigneusement le PBS par 500 microlitres de solution de blocage de perméabilisation pour une incubation d’une heure à température ambiante avec une agitation horizontale douce à 30 à 50 tours par minute. À la fin de l’incubation, laissez les structures 3D sédimenter à nouveau avant de laver soigneusement les structures 3D deux fois dans un millilitre de PBS à 0,1% supplémenté en BSA pendant trois minutes par lavage.
Après le dernier lavage, étiqueter les structures 3D avec 250 microlitres d’anticorps primaires dans PBS pendant deux à trois jours avec une agitation horizontale douce à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver l’échantillon avec cinq lavages de trois minutes et deux lavages de 15 minutes dans un millilitre de PBS BSA à 0,1% par lavage. Après le dernier lavage, étiqueter les structures 3D avec 250 microlitres de l’anticorps secondaire approprié dans du PBS pendant 24 heures à quatre degrés Celsius avec une légère agitation horizontale protégée de la lumière.
Le lendemain, étiquetez les structures 3D avec 250 microlitres de la concentration appropriée de Hoechst 3342 pour une incubation de deux heures à quatre degrés Celsius avec une agitation horizontale douce. À la fin de l’incubation, lavez les structures 3D cinq fois pendant trois minutes et deux fois pendant 15 minutes dans un millilitre de PBS par lavage comme démontré. Après le dernier lavage, transférez les structures 3D sur une microplaque de polystyrène noir à 96 puits et ajoutez doucement 200 microlitres de solution de nettoyage sur les structures, en évitant les bulles.
Ensuite, placez la plaque recouverte de papier d’aluminium à quatre degrés Celsius pendant au moins 48 heures. Pour intégrer de grands modèles de culture cellulaire 3D, utilisez une pointe de pipette d’un millilitre revêtue de BSA pour transférer soigneusement les structures 3D dans un tube de verre à fond plat avec un bouchon de bouteille doublé de PTFE. Une fois les structures déposées, remplacez soigneusement le PBS par de l’éthanol à 70 % pour une incubation de 30 minutes à température ambiante.
À la fin de l’incubation, remplacez l’éthanol à 70% par un millilitre de solution d’éosine Y prête à l’emploi. Agitez le tube et colorez les structures pendant au moins 30 minutes. À la fin de l’incubation, déshydrater les structures avec trois lavages successifs de 30 minutes dans un millilitre d’éthanol à 100% par lavage.
Après la dernière déshydratation, nettoyez les structures 3D avec trois lavages successifs de 30 minutes dans un millilitre de xylène par lavage sous une hotte chimique. Après la dernière immersion au xylène, placez un morceau de tampon de biopsie imbibé de xylène dans un compartiment d’une cassette de tissu microtwin blanc et utilisez une pipette Pasteur en plastique de deux millilitres revêtue de BSA pour transférer les structures 3D sur le tampon. Couvrez les structures 3D avec un autre tampon de biopsie imbibé de xylène pour maintenir les structures 3D en place et fermez la cassette.
Lorsque tous les échantillons ont été transférés, placez les cassettes dans un bain de paraffine de 65 degrés Celsius pendant 30 minutes avant de placer les cassettes dans un bain de paraffine fraîche de 65 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, ajoutez de la paraffine liquide à un moule d’enrobage chauffé à 65 degrés Celsius par échantillon et placez un échantillon de paraffine incorporé dans chaque moule. Agitez doucement les moules jusqu’à ce que toutes les structures 3D tombent au fond et utilisez des pinces fines chauffées à 65 degrés Celsius pour positionner les structures 3D au centre de chaque moule.
Refroidissez le moule jusqu’à ce que la paraffine forme une fine couche solide, fixant la structure 3D en place. Placez une cassette de mouchoir et ajoutez de la paraffine chaude sur le moule. Retirez la moisissure lorsque la paraffine s’est complètement solidifiée.
Pour intégrer de petits modèles de culture cellulaire 3D, lavez doucement les structures 3D trois fois dans un millilitre de TBS par lavage. Après le dernier lavage, retirer autant de TBS que possible sans toucher les structures et ajouter deux gouttes de réactif deux d’un kit d’enrobage de paraffine commerciale. Mélanger doucement en tapotant et ajouter deux gouttes de réactif, une avec tapotement jusqu’à ce que le gel se solidifie.
Utilisez une pince fine pour transférer le gel du puits de la cassette préassemblée du kit et déshydratez l’échantillon de gel incorporé avec des incubations ascendantes d’éthanol et de xylène de 30 minutes dans une hotte comme indiqué. Après la dernière immersion au xylène, placez la cassette dans un bain de paraffine de 65 degrés Celsius pendant la nuit avant d’utiliser de fines pinces pour transférer l’échantillon de paraffine incorporé au centre d’un moule d’enrobage réchauffé à 65 degrés Celsius chargé de paraffine liquide. Ensuite, fixez la structure 3D avec une couche supplémentaire de paraffine comme démontré pour les grands modèles de culture cellulaire 3D.
La coloration tridimensionnelle à monture entière et la microscopie confocale fournissent des informations visuelles sur la composition cellulaire et la position spatiale des modèles de culture 3D à un champ de profondeur allant jusqu’à 200 microns. La haute résolution qui peut être obtenue pour les structures 3D en utilisant ce protocole permet l’application d’algorithmes de segmentation cellulaire et subcellulaire pour la quantification du nombre de cellules et la détection de divers marqueurs cellulaires au sein de différents sous-types cellulaires. L’analyse des montures entières 3D peut être appliquée à des cellules visualisées jusqu’à 200 microns de profondeur, quelles que soient les structures entières.
Au contraire, l’analyse de section 2D peut fournir des informations sur les cellules de toute taille.
