この新しいヒト歯由来オルガノイドモデルは、歯の再生アプリケーションに向けた視点でヒト歯科幹細胞生物学を解読する最初の強力なツールを提供します。現在、この歯オルガノイドモデルは、ヒト歯上皮幹細胞を確実かつ強固に増殖および増殖させるための唯一の利用可能なツールである。このオルガノイドプロトコルは、健康な歯だけでなく、歯科腫瘍や細菌の影響などの罹患した歯からの研究モデルを確立するためにも適用することができます。
このような疾患モデルの探索により、新たな治療標的が明らかになる可能性がある。このオルガノイドモデルは、ヒト歯のエナメル質形成過程を解読するのに非常に役立ち、生成目的でエナメル質などの歯の部分を構築することを可能にする可能性がある。手順を実証するのは、私の研究グループの博士課程の学生であるLara Hemeryckです。
まず、氷の上に置かれた収集媒体中の関連する歯の卵胞を有する第3の大臼歯を採取し、チューブの内容物をペトリ皿に移す。ピンセットで歯を持ち、手術用ブレードを使用して歯包を慎重に隔離します。歯包組織を70%エタノールの最初のウェルに20秒間短時間置き、次に次の死のエタノールプレートに20秒間移し、さらに第3のエタノールウェルに移すことによって、残りの血液を歯卵胞から洗い流す。
リン酸緩衝生理食塩水ウェルで3回リンスし続け、続いて残りの3つの歯包収集培地ウェルで歯包を合計で最大20分間すすぎます。すすぎた歯の卵胞を新しいペトリ皿に移す。パラホルムアルデヒド固定のために歯包の1つの小片を切断し、500マイクロリットルの収集培地を含む微小遠心チューブに最大6時間保存する。
残りの歯卵胞を小片に細かく刻み、4ミリリットルの予温解離培地を含む15ミリリットルのチューブに移し、チューブを摂氏37度で水浴中で2時間インキュベートする。15分毎に、歯卵胞解離培地をピペットし、ガラスピペットを用いて上下に混合し、組織崩壊をスピードアップした。歯の卵胞の破片が観察されなくなったら、狭く磨かれた火で磨かれたパスツールピペットを使用して解離を進めます。
その間に、100マイクロリットルのDNaseを含む10ミリリットルの培地Aを準備し、解離した歯包を有する各チューブにこの培地を5ミリリットル加える。室温で1分間インキュベートする。このステップで1人の患者から解離した歯卵胞のいくつかのチューブを結合し、ろ過した細胞懸濁液を摂氏4度で10分間、200倍gで遠心分離する。
上清を取り除きます。ペレットを1ミリリットルの無血清規定培地に再懸濁し、細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心管に移す。自動細胞カウンターを使用して細胞濃度を計算し、播種できるウェルの数を計算します。
最終混合物は、細胞懸濁液および基底膜マトリックスから30〜70の比率で構成される。適量の上清を除去し、それをゆっくりと再懸濁して、めっき用の細胞懸濁液に対する氷冷基底膜マトリックスの70対30の比率を得た。基底膜マトリックスに再懸濁したら、地下膜マトリックスの固化を避けるために微量遠心管を氷上に保持します。
20マイクロリットルの基底膜マトリックス液滴を予熱した48穴培養プレートの中央にピペットで留める。プレートを裏返し、摂氏37度の1.9%二酸化炭素インキュベーターに20分間固めます。rho関連キナーゼ阻害剤およびアムホテリシンBを歯オルガノイド培地に加え、37°Cの水浴中で培地を予温する。
インキュベーターから48ウェルプレートを取ります。それを直立させ、調製した予備加温培地の250マイクロリットルを細胞を含む基底膜マトリックス液滴と共に各ウェルに加え、プレートを二酸化炭素インキュベーターに戻す。ミディアムをリフレッシュするには、プレートを 45 度の角度で傾けます。
基底膜マトリックス液滴に触れないようにしながら、前の培地を静かに取り除き、2〜3日ごとに250マイクロリットルの新しい予温歯オルガノイド培地を加える。オルガノイドの通過を行うには、オルガノイドを含むウェルから培地を除去し、最大4つのコンフルエントウェルをプールする。オルガノイドを採取するには、ウェルあたり400マイクロリットルの氷冷無血清規定培地を膜マトリックス液滴に直接加え、液滴全体が外れるまで培地を上下に繰り返しピペットします。
ウェルがプールされている場合は、最初のウェルから次のウェルに400マイクロリットルを移して、液滴を含むオルガノイドを取り外します。外れたオルガノイドアセンブリを1.5マイクロリットルの微量遠心チューブに移し、すべてのオルガノイド構造がウェルから収集されるまで無血清の定義培地の添加を繰り返す。200回gで4°Cで5分間遠心分離します。
遠沈管から上清を取り出し、ペレットをTrypLE Expressの予め温めたアリコートに再懸濁する。400マイクロリットルの氷冷無血清定義培地を加えて酵素を失活させ、摂氏4度で5分間、200倍gで遠心分離する。上清を取り除きます。
氷冷無血清の定義培地で先端をプレコートし、オルガノイドペレットを滅菌状態で再懸濁する。低継代法用に定義された200マイクロリットルの氷冷無血清培地にペレットを再懸濁する。完全に空になったピペットチップをマイクロ遠心チューブの底に押し当てて直径を小さくします。
ピペットを5分間上下させて、オルガノイドを機械的に破壊します。より高い継代法では、P1000チップを備えた700マイクロリットルの氷冷無血清定義培地にペレットを再懸濁する。このP1000チップにP200チップを追加し、氷冷無血清の定義培地でプレコートします。
ピペットの音量設定を調整することで、気泡の発生を防ぎます。オルガノイドとピペットで中容量の少なくとも90%を5分間上下させ、オルガノイドを機械的に破壊します。オルガノイドは、典型的には、歯の卵胞細胞播種後2週間で発症する。
オルガノイドは、11通路まで長期間拡張可能である。基底膜マトリックス液滴あたり約20,000個の細胞を播種すると、最適な密度のオルガノイドが得られるが、より高い細胞数を播種すると、成長するためのスペースが不十分であるため、高密度で同様のオルガノイドが最適ではないオルガノイドが増殖する。開発されたオルガノイドは、緻密な外観を示し、高い核細胞質比を示す細胞を含む。
さらに、オルガノイドは、それらの上皮起源を確認するERMマーカーサイトケラチン14およびP63、CD44、およびインテグリンα−6などの他の提案されたERMマーカーを発現する。オルガノイドは、マウスにおいてよく知られているDESCマーカーであるSOX2を発現する。興味深いことに、エナメル質マトリックスの主成分であるアメロゲニンもオルガノイドで発現している。
オルガノイドは、マーカーの安定した発現によって示されるように、継代中にERMMステム表現型を保持する。最適な長期オルガノイド増殖のためには、推奨継代法の意味または低継代法もしくは高継代法を使用することが不可欠である。一旦形成されると、オルガノイドは、アメロジェネシスプロセスをさらに精査するために使用することができ、そしてエナメル質マトリックス沈着は、現在歯科研究において達成されていない。
この技術は、歯科上皮幹細胞生物学、エナメル質形成の過程、および正しい歯形成に不可欠な相互作用である歯間葉との相互作用の探求を可能にする。
