人間の心臓組織のエンジニアリングにおける主要な課題の1つは、その血管化を含む。当研究室では、生体内で見つかった細胞を共培養することで、ヒト心臓のインビトロモデルを開発しました。これらには、心臓筋細胞、心臓線維芽細胞および心臓内皮細胞が含まれる。
これらの細胞は、分子、細胞、および細胞外の成分を含むヒト心臓の微小環境の再現を可能にします。私たちは、薬物毒性エッセイのための異なる薬物をテストするために私たちの研究室でそれらを使用しています。これらには、ドキソルビシン、その治療後何年も後に人間の心臓に影響を与えるよく知られた心毒性薬が含まれます。
我々は、回転楕円体を形成する前に、心臓線維芽細胞、内皮細胞および筋細胞を別々に培養する。心筋細胞を育てるため、バイアルをマイナス80度から採取し、水浴で4分間37度で温めます。その後、クライオバイアルに70%エタノールを吹き付け、バイオセーフティキャビネットに移動します。
細胞懸濁液をそっと回収し、15ミリリットルのファルコンチューブに移します。私たちは、プリウォームメッキ培地の1ミリリットルを収集し、クライオバイアルを一度リンスし、50ミリリットルファルコンチューブに追加し、4秒ごとに一度に1滴。めっき媒体に加えながら、ファルコンチューブを軽く振ります。
セルピペットで、7ミリリットルのメッキ媒体を回収し、15ミリリットルのファルコンチューブにそっと加えます。最終的なメッキ媒体をファルコンチューブに添加したら、細胞懸濁液をフィブロネクチンコード化された組織フラスコに移す。最後に、細胞をインキュベーターに移動します。
2日後、培養器から組織フラスコを採取し、顕微鏡下で細胞合流をチェックします。この時点で、フラスコをバイオセーフティキャビネットに移動し、めっき媒体を取り除きます。同じめっき培地で細胞を4、5回、組織フラスコからやさしくすすめます。
私たちは、新鮮なメンテナンス培地に置き換え、1〜2日のインキュベーターに移動します。私たちが文化の吊り下げを作成する日に、私たちはインキュベーターから3つの細胞タイプすべてを収集します。私たちは、メディアを取り除くことによって細胞にチップします。
私たちは、PBSの3ミリリットルでそれらをすすいでいます。そして最後に、細胞にチップを追加します。フラスコは、その後、インキュベーターに移動し、最大5分間インキュベートされます。
心臓スフェロイドを生成するために、吊り下げ落ちにつき20,000個の細胞を共培養する。これらには、10,000個の心筋細胞、千個の心臓線維芽細胞および5,000個の心臓内細胞が含まれる。これらは、吊り下げドロップ384ウェルプレートで共同培養される。
それらは私達の液体の処理システムを使用してめっきされる。また、培養液がインキュベーターで乾燥するのを防ぐために、吊り下げドロッププレートの側壁にPBSを追加します。細胞を含む吊り下げ板をインキュベーターに慎重に移動します。
3~4日間の間に、スフェロイドが形成されます。インキュベーターから吊り下げ板を回収し、各ウェル内にスフェロイドが形成されていることを確認します。これらの画像に示すように、各ウェルの中央に一連の回転楕円体があります。
形成後、スフェロイドを採取し、コラーゲンゲルに埋め込みます。ピペットチップを内側に切り取って、回転楕円体の損傷を防ぎます。スフェロイドは収集され、50ミリリットルのファルコンチューブに移され、そこで一緒に引っ張られます。
スフェロイド懸濁液を300Gで5分間回転させ、培地から分離します。私たちは、スフェロイドを画像化するために暗い壁の96ウェルプレートを使用し、メディアを取り除くか、ファルコンチューブ内のコラーゲンゲルに置き換えます。水酸化ナトリウムは、黒壁プレートにメッキされる前に、スフェロイドゲル懸濁液に添加されます。
100マイクロリットルのスフェロイド懸濁液を各ウェルに加え、37度で30分間インキュベートする。ドキソルビシンおよび他の薬剤を含む薬物は、スフェロイドプレートに添加され、24時間インキュベートされる。翌日、カルシウムAMとエチジウムホモジマーを含む溶液を調製し、それぞれ細胞の下に生きた標識を行った。
この溶液は、このフィルタープレートにダイムを添加するに調製される。その後、スフェロイドを37度で1時間インキュベートする。プレートリーダーを使用して、AMカルシウムの蛍光とプレート中のエチジウムホモモマーを測定します。
これらの測定値は、当社のソフトウェアが統計分析を行うために使用されます。イオン光学系を用いて異なる薬剤で処理したスフェロイドの収縮活性を測定する。回転楕円体は、2つの電極間の段階に移動する。
これらは、フィールド電位によって契約活動を制御および測定することができます。このようにして、異なる電圧と周波数範囲をテストして、回転楕円体を刺激することができます。その時点での回転楕円体を画像化し、それらの測定に使用する。
ドキソルビシンを受け取らなかったスフェロイドは、電気刺激に続いて構築することができる。逆に、ドキソルビシン処理されたスフェロイドは収縮しない。各スフェロイド内の内皮細胞ネットワーク形態を可視化するために、室温で1時間4%パラホルムアルデヒド溶液で固定した。
ゲルを通して溶液の穏やかな浸透を可能にするシェーカーにプレートを移動しました。PFAを取り出し、0.01%の酸化ナトリウムを含むPBS溶液で3回リンスする。私たちは、室温で20分間PVSAにトリトンXの0.02%溶液を加えることによって、当然のことながら動員をもたらしました。
ブロッキング溶液はPBCに3%BSAを含み、その後室温で1時間プレートに添加される。CD31に対する一次抗体を含有する溶液。内皮のマーカーをプレートに追加し、その後4度で一晩インキュベートする。
翌日、一次抗体溶液を取り除き、0.01%の酸化ナトリウムを含むPBS溶液でプレートを3回リンスした。六六体染色を含む二次抗体溶液もプレートに添加され、その後4度で一晩インキュベートされる。最後に、第2の抗体溶液を取り除き、0.01%の酸化ナトリウムを含むPBS溶液でプレートを3回リンスした。
一次および二次抗体で留まり、プレートは共焦点顕微鏡を使用して画像化することができます。適切な血管ネットワークは、心臓細胞の生存および機能にとって重要である。心臓スフェロイドは、心臓細胞の単層培養と比較して、ヒト心臓に存在する細胞をよりよく再現する内皮細胞ネットワークを提示する。
ユニークな特徴を考えると、心臓回転楕円体は心血管研究のためのインビトロテストのための高度なツールを表す。
