この方法は、モデルの構築とNAFLDに対するプラチコジンDの保護効果の調査を可能にするAML-12細胞の使用を示しています。動物モデルの使用に過度に依存すると、治療薬開発の負担が増大します。NAFLD医薬品開発の初期段階で細胞モデルを使用することは、より実用的で費用効果が高い。
このTCMモデルは、プラチコジンDの生物学的機能の理解を深め、NAFLDの治療のための他のTCMの使用を研究するのに役立つ可能性があります。まず、1ウェルあたり1ミリリットルのAML-12細胞を12ウェルプレートに播種します。次に、12ウェルプレートを4つの異なる治療群に分け、それらをコントロール、PD処理、PA処理、およびPAプラスPD処理群としてラベル付けします。
ウェルあたり1ミリリットルの正常細胞培養培地をコントロールおよびPD処理群に加えます。300マイクロモルのパルミチン酸を添加した1ミリリットルの正常細胞培養培地をPA処理群およびPAプラスPD処理群に加える。24時間のインキュベーション後、細胞の培養液を取り除き、1ミリリットルの無血清培地で細胞を2回洗浄します。
次に、コントロール群にビヒクルを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを、PD処理群に1マイクロモルのプラチコジンDを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを添加する。PA処理群にパルミチン酸300マイクロモルを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを、PA添加PD処理群にパルミチン酸300マイクロモルおよびプラチコジンD1マイクロモルを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを添加する。細胞を24時間処理した後、ウェルあたり1ミリリットルの1X PBSで細胞を3回洗浄します。
次いで、ウェル当たり100マイクロリットルの10マイクロモルDCFH-DAで細胞を染色する。細胞を暗所で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を1X PBSで3回洗浄し、各ウェルに1ミリリットルの1X PBSを加えます。
12ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、20倍の対物レンズを使用して、200倍の倍率で細胞の形態を観察します。ミトコンドリア膜電位を測定するには、以前に調製した処理細胞をウェルあたり1ミリリットルの1X PBSで3回洗浄します。次に、1ミリリットルあたり5マイクログラムの100マイクロリットルのJC-1作業溶液で細胞を染色し、暗所で摂氏37度で30分間細胞をインキュベートします。
次に、細胞を1X PBSで3回洗浄し、各ウェルに1ミリリットルの1X PBSを加えます。12ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、20倍の対物レンズを使用して、200倍の倍率で細胞の形態を観察します。処理した細胞を溶解し、細胞溶解液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。
チューブを12, 000 Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。次に、5X SDS-PAGEサンプルローディングバッファーを細胞ライセート上清に1対4の容量比で加えます。次に、調製した12%SDS-PAGEゲルを12ウェルで電気泳動槽に入れ、超純水で希釈した1X SDSアップサンプルバッファーを推奨高さ限界まで加えます。
SDS-PAGE電気泳動後、0.45ミクロンのPVDFメンブレンへのタンパク質の電気転写を実行します。ブロッキングバッファーで希釈した5ミリリットルの一次抗体でメンブレンをインキュベートします。LC-III、p62、およびベータアクチンに特異的な抗体を使用してください。
摂氏4度で一晩インキュベートします。次いで、PVDF膜をブロッキングバッファー中で1〜10,000に希釈したウサギ抗マウスLGG HRP二次抗体と共にインキュベートする。メンブレンを光から保護された室温で2時間インキュベートします。
インキュベーション後、PVDFメンブレンをラップの上に置きます。適量のECL作業溶液を加え、2分間インキュベートします。次に、ECL作業溶液を取り出し、画像現像のためにイメージングシステムでPVDF膜を露出させます。
DCFH-DA染色は、プラチコジンDがALM-12細胞の細胞内ROSレベルを有意に低下させる可能性があることを示し、この処理が細胞の酸化ストレスを軽減できることを示しています。また,JC-1モノマーまたは脱分極ミトコンドリアを表す緑色蛍光はパルミチン酸処理細胞の方が未処理細胞よりも高く,JC-1二量体または偏光ミトコンドリアを表す赤色蛍光はパルミチン酸処理細胞の方が未処理細胞よりも低く,パルミチン酸誘導MMP脱分極を示した。また、プラチコジンD処理群では、モデル群と比較して、JC-1モノマーの二量体に対する比率が減少し、パルミチン酸誘導MMPを改善できることが示された。
オートファジー関連タンパク質LC-IIIおよびp62のタンパク質発現レベルをウェスタンブロッティングにより調べた。LC-32とLC-31の比率は有意に減少し、p62のタンパク質発現量はパルミチン酸で処理した後に増加した。一方、プラチコジンDはp62のタンパク質発現量を有意に低下させ、LC-32とLC-31の比率を増加させ、パルミチン酸によって誘導されるオートファジーフラックスの回復を示しました。
陰性対照群の細胞の蛍光値が比較的高い場合は、必要に応じて蛍光プローブの使用濃度を調整することができる。
