単一分子FRETは、リボソームタンパク質生合成プロセスに適したスケールであるナノメートルの距離で起こっているダイナミクスを捕捉することができます。リボソームは、複数の因子と成分を同種に調整することによって機能し、これは本質的に不均一である。単一分子法は、この不均一な平均効果によって制限されることなく、各リボソームを追跡することができる。
この方法は、抗生物質が薬剤耐性細菌感染症に向けて新薬を開発するためにリボソーム機能を阻害する方法を明らかにする。開始の EFTU、NOG、PAG ミックスを摂氏 37 度で 37° の比率で 2 分間混合して PRE を準備します。インキュベーション後、1.1モルスクロースクッション超遠心分離を100,000回G.100,000倍で使用してPREを精製し、開始EFTU、WG、PHEミックスを摂氏37度で17°Cで1対2対2の比率で10分間混合してPOSTを準備します。
インキュベーション後、1.1モルスクロースクッション超遠心化を使用して100,000倍G.直径1ミリメートルの6組の穴と1.5顕微鏡ガラスカバーリップを含む顕微鏡ガラススライドをクリーニングします。きれいなスライドとカバーリップを摂氏300度で3時間焼き、カバースリップにアミノサリンをコーティングします。きれいな層のフードで、表面に1つのカバースリップを平らに置きます。
慎重に上端にPEG溶液の60マイクロリットルをドロップし、その上に別のカバースリップを置き、毛細血管効果がそれらの間に溶液を広げ、気泡が形成されないようにします。カバーリップの 2 つのペアに対して、これらの手順を繰り返します。水で満たされた空の先端箱にこれらのカバーリップを保存し、暗闇の中で3時間インキュベートします。
3時間後、カバーリップを分離し、3つの連続したるつぼで水ですすいで、乾燥窒素流でパージします。ガラススライドの穴から鋭いピペットの先端を引っ張り、しっかりとフィットします。ガラス表面で完全に平らになるまでシャープエンドを削り取り、その上にチャネルパターンを持つ両面テープをカットします。
平らな側のガラススライドに貼り付けます。コーティングされたカバースリップを両面テープに貼り付け、それを押してサンプルチャンバーのタイトなシールを作り、コーティングされた側が内側に向かっていることを確認します。コンピュータと顕微鏡スイッチの電源を入れます。
レーザー制御インターフェースを起動し、レーザーをオンにします。レーザーコントロールボックスのイネーブルボタンを押して、レーザーを温める。カメラの電源を入れ、顕微鏡に関連するソフトウェアプログラムを起動します。
上のシャッターをクリックし、ランプをクリックします。TAM10 バッファーの 1 ミリリットルに 5%Tween-20 の 10 マイクロリットルを追加して Tween バッファーを使用して TAM10 を準備します。小さいマイクロ遠心分離管のブドウ糖オキシダーゼの3ミリグラムを秤量することによってデオキシ溶液を準備し、それにカタラーゼの45マイクロリットルを加える。
チューブを静かに渦を入れ、固体を溶解させる。マイクロ遠心分離機で20,000倍Gで1分間スピンし、上清を取ります。30%グルコース溶液、200ミリモルトロロックス溶液、および0.5ミリグラムのストレプトアビジン溶液をテキスト原稿の指示に従って調製する。
ターフの目的にイメージングオイルを1滴追加します。目的にサンプルチャンバーを置きます。10マイクロリットルのストレプトアビジン溶液でチャンバーを充填し、1分間待ちます。
チャンバーを30マイクロリットルのTAM10でTweenバッファーで洗浄し、折り畳まれたフィルターペーパーでランスルー溶液を回収します。洗濯後1分待ちます。リボソーム複合体PREまたはPOSTをTWEENバッファーでTAM10で10〜15ナノモル濃度に希釈します。
20マイクロリットルのリボソームサンプルをチャネルにロードし、2分間待ちます。50マイクロリットルのTAM10バッファーと0.5マイクロリットルのデオキシグルコースおよびトロロクス溶液を使用してイメージングバッファを作ります。よく混ぜます。
30ミリリットルのイメージングバッファーでチャンバーを洗い流します。画像を取得するためのカメラを設定します。上のシャッターをクリックし、ランプをオフにします。
カメラの取得を開始し、2 つの個別のカメラとオーバーレイを表す 3 つのウィンドウに画像を広げます。取得メニューで、キャプチャタイムラプスを選択し、自動的にキャプチャをクリックします。適切なファイル名、ファイルパス、ループ数を設定し、今すぐ実行をクリックします。
画像の取得が完了したらポップアップウィンドウを閉じ、取得したNDファイルを開きます。ROI、シンプルなROIエディタをクリックし、オプション円を選択します。画像のROIを選択し、完了したら[完了]をクリックします。
測定、時間測定をクリックして、データをプロットまたはスプレッドシートとして表示します。エクスポートパラメータを設定するには、エクスポートタブを開き、エクスポートをクリックして強度を保存します。最後に、適切なアプリケーションを使用してエクスポートされたファイルを開きます。
L27標識残渣からAサイトまたはPサイトtRNAまでの距離は、それぞれ61または52オングストロームであり、0.47および0.65のFRET効率に対応する。ドナーおよびアクセクサチャネルから蛍光強度を取得し、タイムラプスとしてプロットした。ドナー漂白後、アクセクサに直接興奮が起こりなかったので、両方の痕跡がベースラインに近づいた。
アクセプター漂白後、反応経路が少ないためドナー強度が増加し、励起エネルギーが消散した。個々のリボソームは、TRNAの揺れ動きによって異なる変動を示し、L27への距離変動を引き起こした。Puromyccinアッセイ、アッセイ、トープリンティングアッセイ、マススペックなどの他の方法は、単分子FRET法に無料であり、タンパク質合成に関する詳細を明らかにします。
単一分子FRETは、多くの生物学的プロセスがナノメートルの範囲でミリ秒のタイムスケールで起こるので、広範なアプリケーションを有する。適切な位置で適切な染料をタグ付けすることで、他の多くのダイナミクスが明らかにすることができます。
