このプロトコルは、タンパク質の酸化シスチン残基の部位特異的同定を可能にする方法を記載する。この方法では、酸化シスチン残基の定量的および部位特異的データをさまざまなサンプルタイプから生成できます。補助捕捉手順を開始するには、沈殿したタンパク質ペレットをアセトンで2回洗浄し、20, 500 G、摂氏4度で10分間遠心分離します。
次に、アセトンをデカントし、マイクロピペットで残りのアセトンを取り除きます。ガラス血清学的ピペットを使用して、3ミリリットルの新鮮な氷冷アセトンをチューブに加え、チューブを数回反転させてよく混合します。2回目の洗浄後、ペレットを乾燥させすぎずに1〜2分間風乾させます。
1ミリリットルのバッファーBを乾燥タンパク質ペレットに加える。タンパク質を可溶化するには、短いボルテックスとともに、一度に15〜30秒間、250ワットの出力を有するバス超音波処理器でペレットを繰り返し超音波処理する。ビシンコニン酸またはBCAアッセイを実行して、タンパク質濃度を測定します。
タンパク質濃度を標準化するには、500マイクログラムのタンパク質サンプルを0.5ミリリットル、10キロダルトンの遠心フィルターに移し、再懸濁バッファーでサンプルを500マイクロリットルまで容量アップします。遠心フィルター内の容量が100マイクロリットル未満になるまで、室温で14, 000 Gでタンパク質バッファー混合物を遠心分離します。収集チューブ内のフィルターを反転させてサンプルを収集します。
サンプルを1000 Gで2分間遠心分離し、バッファーCを加えて最終容量500マイクロリットルにします。タンパク質チオールを減らすには、20マイクロリットルの500ミリモルのジチオスレイトールまたはDTTをサンプルに加えて最終濃度20ミリモルとし、850RPMで振とうしながら摂氏37度で30分間サンプルをインキュベートします。還元後、遠心フィルター内の容量が100マイクロリットル未満になるまで、室温で14, 000 Gでサンプルを0.5ミリリットルの10キロダルトン遠心フィルターに遠心分離します。
バッファーDを加えて容量を500マイクロリットルにし、遠心分離を繰り返します。4回目の遠心分離後、回収チューブ内のフィルターを反転させてサンプルを回収し、1000Gで2分間遠心分離する。次に、BCAアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。
次に、スピンカラムを真空マニホールド上に置き、マイクロピペットを用いて、調製したばかりのチオールアフィニティー樹脂スラリー500マイクロリットルを各カラムに移した。水分を除去するために真空を適用します。この手順を1回繰り返して、カラムあたり30ミリグラムの樹脂を取得します。
500マイクロリットルの超純水で樹脂を5回洗浄し、真空を適用して水を除去し、次に新しいチューブ E.In 500マイクロリットルのバッファーで5回洗浄し、最終容量が120マイクロリットルになるまで、150マイクログラムの還元タンパク質サンプルにバッファーCを追加します。タンパク質溶液を、樹脂を含む詰まったスピンカラムに移します。キャップをカラムに置き、850rpmで振とうしながら室温で2時間インキュベートする。
原稿に記載されているように樹脂を洗います。プラグを交換してください。樹脂上でのトリプシン消化を行うには、新たに調製した120マイクロリットルのトリプシン溶液をサンプルに加え、850 RPMで振とうしながら、摂氏37度で一晩カラムをインキュベートします。
翌日、原稿に記載されているように樹脂を複数回洗浄し、プラグを交換します。マイクロピペットを使用して、洗浄した樹脂に40マイクロリットルの100ミリモルのトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液を加えます。次いで、溶解したタンデム質量タグまたはTMT標識試薬70マイクロリットルを加え、850RPMで振とうしながら室温で1時間インキュベートする。
残りのTMT試薬は摂氏マイナス80度で保管してください。レジンを洗浄し、プラグを交換します。20ミリモルのDTTを含むpH 8.0の100ミリモル炭酸水素アンモニウムバッファーを100マイクロリットル加えてTMT標識ペプチドをカラムに添加し、サーマルミキサー上でカラムを室温で850RPMで30分間インキュベートします。
インキュベーション後、カラムを真空マニホールドに置き、真空を適用してサンプルを5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに溶出して溶出を行います。この手順を1回繰り返してから、100マイクロリットルの80%アセトニトリルと0.1%トリフルオロ酢酸をカラムに加えます。カラムを室温で10分間インキュベートした後、同じ5ミリリットルの遠沈管でサンプルを溶出します。
溶出したサンプルを乾燥するまで真空濃縮器に入れます。その後、乾燥ペプチドをさらに使用するまで摂氏マイナス80度で保管します。RAW264.7細胞からのペプチドサンプルの定性分析はSDS-PAGEで実施され、サンプルは処理による異なるレベルの酸化を決定することによって比較されました。
その後、分離したタンパク質をウェスタンブロットで調査し、個々のタンパク質の酸化レベルをさらに調査しました。シスチン含有ペプチドの報告されたイオン強度を液体クロマトグラフィータンデム質量分析法により分析した。iTRAQのチオール酸化化学量論により、個々のシスチン部位レベルで標識された富化および酸化ペプチドを定量した。
タンパク質ペレットを乱すことなくアセトンを慎重に除去します。タンパク質ペレットが完全に可溶化され、正確に定量され、樹脂がスピンカラムに正確に割り当てられていることを確認してください。洗浄ステップ中は必ずレジンを再懸濁してください。
濃縮されたタンパク質およびペプチドのさらなる評価は、SDS-PAGEおよび染色、ウェスタンブロッティングおよび質量分析によって行うことができる。
