超微細構造解析および抗体染色のためのプラナリア卵巣解剖

この方法の目標は、TEMまたは抗体染色による卵母細胞生物学の細胞および細胞内分析のために、プラナリアSchmidtea mediterraneaの卵巣を解剖することです。このプロトコルでは、プラナリア卵巣の局在化と解剖を容易にするために簡単な固定ステップを使用し、以前はアクセスできなかったイメージングの深さと品質を提供します。この技術をこれまで行ったことがない人にとって最大の苦労は、固定後の卵巣の位置を特定することです。

実験の前に性的プラナリアの構造に精通することは役に立ちます。性的成熟を達成するために、週に2回、性的プラナリアに有機肝臓ペーストを与えて実験の準備をします。性的に成熟した線虫を5%N-アセチル-L-システイン(NAC)で室温の皿で5分間処理します。

NACを10ミリリットルの新しく調製した4%パラホルムアルデヒドと交換し、時々振とうしながら室温で1時間ワームを固定します。4%パラホルムアルデヒドを追加してから10分後に、ワームが固定されているので解剖を開始します。上皮の色素沈着を観察して、前頭神経節から尾に向かって伸びる軽い色素沈着の2本の線として現れる腹側神経索を見つけます。

色素沈着を観察して推定卵巣を特定し、その位置を確認します。2つの外科用ナイフを使用して、卵巣の後部と前方に切り込みを入れ、前後のワームの破片を完全に取り除きます。一方のナイフを使用してワームを固定し、もう一方のナイフを解剖に使用します。

切り傷を切るために使用したナイフを清掃します。2つの卵巣を分離するには、卵巣断片の中央線を切り取り、次に断片の腹側を下にして裏返します。タイプ5-SAの尖ったピンセットを2組使用して背側組織を剥がし、腸を露出させます。

ピンセットの先端または柔らかいブラシで腹側組織の上にある腸の枝をそっと取り除き、卵巣を露出させます。周囲の組織を切除して卵巣を取り出します。卵巣を取り出して1.5ミリリットルのチューブに移し、1ミリリットルのPBSで洗います。

背側と腹側の色素沈着パターンを使用して、卵巣の位置を特定しました。余分な組織は、段階的にトリミングされました。卵巣が露出すると、周囲の組織が切除されました。

複数の体細胞型を含む卵巣を、超微細構造解析と免疫蛍光染色の両方に使用しました。解剖された卵巣は、卵子の細胞および細胞内解剖学的構造の高品質なイメージングを可能にします。この手順により、卵子生物学の分子制御を調べるためのRNA干渉実験が可能になります。

この技術は、扁形動物卵子で、核膜が無傷のままではなく核タンパク質をカプセル化する小胞に分解される、つまり閉じた有糸分裂、または断片に壊れる、別名開放有糸分裂という新しい現象の発見につながりました。