L'obiettivo di questo metodo è quello di sezionare le ovaie della Schmidtea mediterranea planaria per l'analisi cellulare e subcellulare della biologia degli ovociti con TEM o colorazione anticorpale. Questo protocollo utilizza una breve fase di fissazione per facilitare la localizzazione e la dissezione delle ovaie planarie, che fornirà una profondità e una qualità di imaging precedentemente inaccessibili. La lotta più grande per chi non ha mai eseguito questa tecnica prima sarà quella di localizzare le ovaie dopo la fissazione.
Sarà utile familiarizzare con l'anatomia delle planarie sessuali prima dell'esperimento. Preparati per l'esperimento alimentando le planarie sessuali con pasta di fegato biologica due volte a settimana per raggiungere la maturità sessuale. Trattare i vermi sessualmente maturi con il 5% di N-acetil-L-cisteina, o NAC, in un piatto a temperatura ambiente per cinque minuti.
Sostituire la NAC con 10 millilitri di paraformaldeide al 4% appena preparata e fissare i vermi per un'ora a temperatura ambiente agitando di tanto in tanto. Iniziare la dissezione 10 minuti dopo l'aggiunta del 4% di paraformaldeide poiché i vermi vengono fissati. Osservare la pigmentazione epiteliale per localizzare le corde nervose ventrali, che appaiono come due linee con una pigmentazione più chiara che va dai gangli cefalici anteriori verso la coda.
Localizzare le ovaie putative osservando la pigmentazione e convalidare la loro posizione. Usando due coltelli chirurgici, praticare dei tagli posteriori e anteriori alle ovaie per rimuovere completamente i frammenti di verme anteriori e posteriori. Usa un coltello per ancorare il verme e l'altro coltello per la dissezione.
Pulire il coltello utilizzato per eseguire i tagli. Per separare le due ovaie, tagliare la linea mediana del frammento dell'ovaio, quindi capovolgere il frammento con il lato ventrale rivolto verso il basso. Usa due paia di pinzette appuntite di tipo 5-SA per staccare il tessuto dorsale e esporre l'intestino.
Rimuovere delicatamente i rami intestinali che si trovano sopra i tessuti ventrali con la punta delle pinzette o una spazzola morbida per esporre l'ovaio. Rimuovere i tessuti circostanti per estrarre l'ovaio. Estrarre le ovaie e trasferirle in un tubo da 1,5 millilitri per lavarle con 1 millilitro di PBS.
I modelli di pigmentazione dorsale e ventrale sono stati utilizzati per localizzare la posizione delle ovaie. Il tessuto in eccesso è stato tagliato via passo dopo passo. Una volta che l'ovaio è stato esposto, il tessuto circostante è stato tagliato via.
Le ovaie contenenti più tipi di cellule somatiche sono state utilizzate sia per l'analisi ultrastrutturale che per la colorazione in immunofluorescenza. Le ovaie sezionate consentono un imaging di alta qualità dell'anatomia cellulare e subcellulare degli ovociti. Questa procedura dovrebbe consentire esperimenti di interferenza dell'RNA per esaminare le regolazioni molecolari della biologia degli ovociti.
Questa tecnica ha portato alla scoperta di un nuovo fenomeno negli ovociti dei vermi piatti che l'involucro nucleare si scompone in vescicole che incapsulano le proteine nucleari invece di rimanere intatte, ovvero la mitosi chiusa, o la rottura in pezzi, nota anche come mitosi aperta.
