Le but de cette méthode est de disséquer les ovaires du Planaire Schmidtea mediterranea pour l’analyse cellulaire et subcellulaire de la biologie des ovocytes avec TEM ou coloration par anticorps. Ce protocole utilise une brève étape de fixation pour faciliter la localisation et la dissection des ovaires planaires, ce qui fournira une profondeur et une qualité d’imagerie auparavant inaccessibles. La plus grande difficulté pour quelqu’un qui n’a jamais pratiqué cette technique auparavant sera de localiser les ovaires après la fixation.
Il sera utile de se familiariser avec l’anatomie des planaires sexuels avant l’expérience. Préparez-vous à l’expérience en nourrissant les planaires sexuels avec de la pâte de foie biologique deux fois par semaine pour atteindre la maturité sexuelle. Traitez les vers sexuellement matures avec 5 % de N-acétyl-L-cystéine, ou NAC, dans une coupelle à température ambiante pendant cinq minutes.
Remplacez le NAC par 10 millilitres de paraformaldéhyde à 4 % fraîchement préparé, et fixez les vers pendant une heure à température ambiante en les secouant de temps en temps. Commencez la dissection 10 minutes après avoir ajouté 4% de paraformaldéhyde pendant que les vers sont en train de se fixer. Observez la pigmentation épithéliale pour localiser les cordons nerveux ventraux, qui apparaissent comme deux lignes avec une pigmentation plus claire allant des ganglions céphaliques antérieurs vers la queue.
Localiser les ovaires présumés en observant la pigmentation et valider leur position. À l’aide de deux couteaux chirurgicaux, faites des incisions à l’arrière et à l’avant des ovaires pour enlever complètement les fragments de vers antérieurs et postérieurs. Utilisez un couteau pour ancrer le ver et l’autre couteau pour la dissection.
Nettoyez le couteau utilisé pour faire les coupes. Pour séparer les deux ovaires, coupez la ligne médiane du fragment d’ovaire, puis retournez le fragment côté ventral vers le bas. Utilisez deux paires de pinces pointues de type 5-SA pour décoller le tissu dorsal afin d’exposer l’intestin.
Retirez délicatement les branches intestinales situées au-dessus des tissus ventraux avec la pointe de la pince à épiler ou une brosse douce pour exposer l’ovaire. Retirez les tissus environnants pour retirer l’ovaire. Retirez les ovaires et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitre pour les laver avec 1 millilitre de PBS.
Les motifs de pigmentation dorsale et ventrale ont été utilisés pour localiser la position des ovaires. L’excès de tissu a été coupé étape par étape. Une fois l’ovaire exposé, le tissu environnant a été coupé.
Des ovaires contenant plusieurs types de cellules somatiques ont été utilisés à la fois pour l’analyse ultrastructurale et la coloration par immunofluorescence. Les ovaires disséqués permettent une imagerie de haute qualité de l’anatomie cellulaire et subcellulaire des ovocytes. Cette procédure devrait permettre des expériences d’interférence d’ARN pour examiner les régulations moléculaires de la biologie des ovocytes.
Cette technique a conduit à la découverte d’un nouveau phénomène dans les ovocytes de vers plats selon lequel l’enveloppe nucléaire se décompose en vésicules encapsulant des protéines nucléaires au lieu de rester intactes, c’est-à-dire la mitose fermée, ou de se briser en morceaux, c’est-à-dire la mitose ouverte.
