דיסקציה פלנרית של השחלה לניתוח אולטרה-סטרוקטורלי וצביעת נוגדנים

מטרת שיטה זו היא לנתח את השחלות של מדיטרנה Schmidtea פלנרית לאנליזה תאית ותת-תאית של ביולוגיה של ביציות עם TEM או צביעת נוגדנים. פרוטוקול זה משתמש בשלב קיבוע קצר כדי להקל על לוקליזציה ודיסקציה של שחלות פלנריות, אשר יספק עומק ואיכות הדמיה כי הם היו נגישים בעבר. המאבק הגדול ביותר עבור מי שמעולם לא ביצע טכניקה זו לפני כן יהיה למקם את השחלות לאחר קיבוע.

היכרות עם האנטומיה של מתכננים מיניים לפני הניסוי תהיה מועילה. התכוננו לניסוי על ידי האכלת פלנרים מיניים במשחת כבד אורגנית פעמיים בשבוע כדי להשיג בגרות מינית. טפלו בתולעים בוגרות מינית עם 5%N-אצטיל-L-ציסטאין, או NAC, בצלחת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

החליפו את NAC ב-10 מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד טרי שהוכן, וקיבעו את התולעים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם רעידות מזדמנות. התחל את הדיסקציה 10 דקות לאחר הוספת 4% paraformaldehyde כמו התולעים להיות קבוע. שימו לב לפיגמנטציה האפיתל כדי לאתר את מיתרי העצבים הגחונים, המופיעים כשני קווים עם פיגמנטציה בהירה יותר העוברת מהגרעינים הצפליים הקדמיים לכיוון הזנב.

אתר את השחלות המשוערות על ידי התבוננות בפיגמנטציה ואמת את מיקומן. באמצעות שני סכינים כירורגיות, לבצע חתכים אחוריים וקדמיים לשחלות כדי להסיר את שברי התולעת הקדמית והאחורית לחלוטין. השתמש בסכין אחת כדי לעגן את התולעת ובסכין השנייה לנתיחה.

נקו את הסכין המשמשת לביצוע החתכים. כדי להפריד בין שתי השחלות, לחתוך בקו האמצעי של שבר השחלה, ולאחר מכן להפוך את הצד הגחוני שבר כלפי מטה. השתמש בשני זוגות של פינצטה מחודדת מסוג 5-SA כדי לקלף את הרקמה הגבית ולחשוף את המעי.

הסירו בעדינות את ענפי המעיים היושבים מעל רקמות הגחון בעזרת קצה הפינצטה או מברשת רכה כדי לחשוף את השחלה. הסר את הרקמות שמסביב כדי להוציא את השחלה. הוציאו את השחלות והעבירו אותן לצינור של 1.5 מיליליטר לשטיפה עם 1 מיליליטר PBS.

תבניות הפיגמנטציה הגבית והגחונית שימשו לאיתור מיקום השחלות. רקמה עודפת נחתכה בצורה שלב אחר שלב. ברגע שהשחלה נחשפה, הרקמה שמסביב נחתכה.

שחלות המכילות סוגי תאים סומטיים מרובים שימשו הן לניתוח אולטרה-סטרוקטורקלי והן לצביעת אימונופלואורסצנטיות. השחלות המנותחות מאפשרות הדמיה באיכות גבוהה של האנטומיה התאית והתת-תאית של הביציות. הליך זה אמור לאפשר ניסויים בהפרעות RNA כדי לבחון תקנות מולקולריות של ביולוגיה של ביציות.

טכניקה זו הובילה לגילוי תופעה חדשה בביציות התולעים השטוחות, שמעטפת הגרעין מתפרקת לשלפוחיות העוטפות חלבונים גרעיניים במקום להישאר שלמות, כלומר מיטוזה סגורה, או נשברות לחתיכות, כלומר מיטוזה פתוחה.