El objetivo de este método es diseccionar los ovarios de la planaria Schmidtea mediterranea para el análisis celular y subcelular de la biología de los ovocitos con TEM o tinción de anticuerpos. Este protocolo utiliza un breve paso de fijación para facilitar la localización y disección de los ovarios planarios, lo que proporcionará una profundidad y calidad de imagen que antes eran inaccesibles. La mayor lucha para alguien que nunca antes ha realizado esta técnica será localizar los ovarios después de la fijación.
Será útil familiarizarse con la anatomía de las planarias sexuales antes del experimento. Prepárese para el experimento alimentando a las planarias sexuales con pasta de hígado orgánica dos veces por semana para lograr la madurez sexual. Trate los gusanos sexualmente maduros con N-acetil-L-cisteína al 5%, o NAC, en un plato a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Reemplace el NAC con 10 mililitros de paraformaldehído al 4% recién preparado y fije los gusanos durante una hora a temperatura ambiente con agitaciones ocasionales. Comience la disección 10 minutos después de agregar 4% de paraformaldehído mientras se fijan los gusanos. Observar la pigmentación epitelial para localizar los cordones nerviosos ventrales, que aparecen como dos líneas con una pigmentación más clara que van desde los ganglios cefálicos anteriores hacia la cola.
Localice los ovarios putativos observando la pigmentación y valide su posición. Con dos cuchillos quirúrgicos, haga cortes posteriores y anteriores a los ovarios para eliminar por completo los fragmentos de gusano anterior y posterior. Use un cuchillo para anclar el gusano y el otro cuchillo para la disección.
Limpia el cuchillo utilizado para hacer los cortes. Para separar los dos ovarios, haz un corte en la línea media del fragmento de ovario y luego voltea el fragmento con el lado ventral hacia abajo. Use dos pares de pinzas puntiagudas tipo 5-SA para despegar el tejido dorsal y exponer el intestino.
Retire suavemente las ramas intestinales que se encuentran sobre los tejidos ventrales con la punta de las pinzas o con un cepillo suave para exponer el ovario. Extirpar los tejidos circundantes para extraer el ovario. Saca los ovarios y transfiérelos a un tubo de 1,5 mililitros para lavarlos con 1 mililitro de PBS.
Se utilizaron los patrones de pigmentación dorsal y ventral para localizar la posición de los ovarios. El exceso de tejido se recortó paso a paso. Una vez que el ovario quedó expuesto, se recortó el tejido circundante.
Los ovarios que contenían múltiples tipos de células somáticas se utilizaron tanto para el análisis ultraestructural como para la tinción con inmunofluorescencia. Los ovarios disecados permiten obtener imágenes de alta calidad de la anatomía celular y subcelular de los ovocitos. Este procedimiento debería permitir experimentos de interferencia de ARN para examinar las regulaciones moleculares de la biología de los ovocitos.
Esta técnica condujo al descubrimiento de un nuevo fenómeno en los ovocitos de los gusanos planos de que la envoltura nuclear se descompone en vesículas que encapsulan proteínas nucleares en lugar de permanecer intactas, también conocida como mitosis cerrada, o romperse en pedazos, también conocida como mitosis abierta.
