Ultrastrüktürel Analiz ve Antikor Boyama için Planaryan Over Diseksiyonu

Bu yöntemin amacı, oosit biyolojisinin TEM veya antikor boyama ile hücresel ve hücre altı analizi için planaryal Schmidtea mediterranea'nın yumurtalıklarını incelemektir. Bu protokol, planaryal yumurtalıkların lokalizasyonunu ve diseksiyonunu kolaylaştırmak için kısa bir fiksasyon adımı kullanır, bu da daha önce erişilemeyen görüntüleme derinliği ve kalitesini sağlayacaktır. Bu tekniği daha önce hiç uygulamamış biri için en büyük mücadele sabitleme sonrası yumurtalıkların lokalizasyonu olacaktır.

Deneyden önce cinsel planaryaların anatomisine aşina olmak yardımcı olacaktır. Cinsel olgunluğa ulaşmak için cinsel planaryaları haftada iki kez organik karaciğer macunu ile besleyerek deneye hazırlanın. Cinsel olarak olgun solucanları% 5 N-asetil-L-sistein veya NAC ile oda sıcaklığında bir tabakta beş dakika tedavi edin.

NAC'ı 10 mililitre taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit ile değiştirin ve solucanları ara sıra çalkalayarak oda sıcaklığında bir saat sabitleyin. Solucanlar sabitlenirken %4 paraformaldehit ekledikten 10 dakika sonra diseksiyona başlayın. Anterior sefalik gangliyonlardan kuyruğa doğru uzanan daha hafif pigmentasyona sahip iki çizgi halinde görünen ventral sinir kordonlarını bulmak için epitel pigmentasyonunu gözlemleyin.

Pigmentasyonu gözlemleyerek varsayılan yumurtalıkları bulun ve konumlarını doğrulayın. İki cerrahi bıçak kullanarak, ön ve arka solucan parçalarını tamamen çıkarmak için yumurtalıkların arkasından ve önünden kesiler yapın. Solucanı sabitlemek için bir bıçak ve diseksiyon için diğer bıçağı kullanın.

Kesimleri yapmak için kullanılan bıçağı temizleyin. İki yumurtalığı ayırmak için, yumurtalık parçasının orta çizgisinde kesin, ardından parçayı ventral tarafı aşağı çevirin. Bağırsağı açığa çıkarmak için sırt dokusunu soymak için iki çift tip 5-SA sivri uçlu cımbız kullanın.

Yumurtalığı ortaya çıkarmak için cımbızın ucuyla veya yumuşak bir fırça ile ventral dokuların üzerinde oturan bağırsak dallarını nazikçe çıkarın. Yumurtalığı çıkarmak için çevredeki dokuları çıkarın. Yumurtalıkları çıkarın ve 1 mililitre PBS ile yıkamak için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Yumurtalıkların pozisyonunu belirlemek için dorsal ve ventral pigmentasyon paternleri kullanıldı. Fazla doku adım adım kesildi. Yumurtalık açığa çıktıktan sonra, çevredeki doku kesildi.

Birden fazla somatik hücre tipi içeren yumurtalıklar hem ultrastrüktürel analiz hem de immünofloresan boyama için kullanıldı. Diseke edilen yumurtalıklar, oositlerin hücresel ve hücre altı anatomisinin yüksek kalitede görüntülenmesine izin verir. Bu prosedür, oosit biyolojisinin moleküler düzenlemelerini incelemek için RNA girişim deneylerine izin vermelidir.

Bu teknik, yassı kurt oositlerinde, nükleer zarfın bozulmadan kalmak, yani kapalı mitoz veya parçalara ayrılmak, yani açık mitoz yerine nükleer proteinleri kapsülleyen veziküllere ayrıldığı yeni bir fenomenin keşfedilmesine yol açtı.