タンパク質とタンパク質相互作用の研究は、多くの生物学的プロセスの調節を理解する.ここでは、Yジョンの靴とcoによって初期に記述された手順を示します。2007年の労働者は、著者がFRETと組み合わせてBiFCを使用して、3つのタンパク質分子間の三者間の相互作用を検証した。
しかし、この手順にはFRET測定を立証するための蛍光寿命測定が含まれています。三者間相互作用を実証するために、我々はホモメ化することが知られているタンパク質を選択しました。さらに、このプロトコルではCタンパク質と呼ばれるタンパク質のカルシウムセンサーと相互作用することも社内で検証されています。
MNCタンパク質は細胞質中で相互作用する。この技術では、2つのタンパク質が分割されたYFPタンパク質でタグ付けされます。彼らの相互作用は、FRETドナーとして機能するCFPでタグ付けされた第3の相互作用パートナーにFRETアクセプターとして機能する機能的YFPの返還をもたらす。
まず、PCRによりM遺伝子およびC遺伝子である目的の遺伝子のコード配列をPCRにより増幅し、適切なエントリベクターでクローン化します。制限消化とDNAシーケンシングにより、プレートを含む抗生物質で選択されたクローンを検証します。再構成された CDS'エントリクローンから宛先ベクトルに動員します。
この実験で使用されるすべてのベクターを表 1 に示します。最後に、電気ポレーションにより、先ベクトルを用いてGV3101細胞を形変える。ここでは、ニコティアナベンタミアナ植物はまだ成長室で制御された条件で4〜6の休暇段階を成長させます。
2:1:1の比率で土壌、ココピートと堆肥を混合することによって土壌ミックスを準備します。このミックスの1インチの厚い層をプラスチックトレイに広げて、土壌ベッドを作り、少しの水で飽和させます。土の上に約200の種子を振りかけ、約1センチメートルの立ち水の大きなトレイに移します。
このトレイをラップで覆い、湿気チャンバーを作ります。このトレイを16時間の光と8時間の暗いサイクルで摂氏23度に設定された成長室に移します。2週間後、若い苗を水飽和土壌ミックスを含む小さな3〜4インチのポットに移します。
これらのポットをプラスチックトレイに入れ、さらに4週間チャンバーを成長させるためにそれらを転送します。アグロインフィルトレーションの場合、細菌株は、適切な比率でP19株のアグロバクテリウムと一緒に新たにサブ培養し、混合する必要があります。10 mlの縞板からBiFCおよびFRETの構造を含むGV3101のアグロバクテリウム株を接種することによってこの手順を開始しなさい。
適切な抗生物質を含むスープに。並んで、また、遺伝子導入サイレンシングを防ぐために添加されるアグロバクテリアのP19株の培養を開始する。フラスコをアルミホイルで覆い、インキュベーターシェーカーに入れておき、摂氏28度を170RPMで16時間セットします。
一晩成長した後、これらの培養物の1mlを使い捨てキュービットに移し、分光光度計を用いて600ナノメートルで光学密度を測定した。最終的なODが0.5であり、P19のそれが2mlの総容積で0.3になるように、株を含む適切なBiFCおよびFRETパートナーの培養物を混合する。
これらの比率を達成するために、これらの計算のために画面に示されている式に従います。3000Gの混合したアグロバクテリウム培養物を室温で5分間遠心し、上清を慎重に捨てる。ペレットを2mlに吊り下げたい。
浸潤バッファー。均質な細胞懸濁液の細胞を完全に再中断するには、ボルテックスミキサーを使用する必要があります。この後、3時間暗闇の中で室温でチューブをインキュベートします。
一方、それが浸透しようとしている構築混合物のために各植木鉢にラベルを付けます。1mlの針なし注射器を農薬ミックスで満たします。
シリンジの先端を完全に広げた葉の脇腹側に軽くしっかりと押し付け、反対側の葉を支えます。溶液がシリンジ先端の2〜3倍相当の葉領域で満杯になるまで、プランジャーをそっと押します。1つの葉の最大4つの斑点で細菌混合物に浸透し、1種類の浸潤のために3〜4つの葉のためにこの手順を繰り返します。
また、浸潤のために構成体ごとに少なくとも2つの植物を含む。70%アルコールで手を拭くか、クロス汚染を防ぐために手袋を交換してください。すべてのポットをトレイに移し、同じ成長条件で成長チャンバーでインキュベートします。
蛍光顕微鏡を使用して、農浸潤葉の小さな部分を確認します。YFPとCFPの両方からの蛍光が細胞内で検出可能な場合、BiFC FRET-FLIMアッセイ用の共焦点顕微鏡に進みます。我々の場合、この分析は、アグロインフィルトレーションの3日後に行われた。
植物は、注射器の先端の傷から5〜8mm離れた顕微鏡カット平方葉サンプルの下で視覚化し、蒸留水に取り付ける準備が整いました。その上にきれいなカバースリップを置き、シールします。
これらのサンプルを共焦点レーザー走査顕微鏡で可視化します。この手順では、2つのタンパク質間の相互作用を決定し、定量化する基礎は、FRETの効率を計算するために使用されるアクセクターとの相互作用に対するFRETドナーパートナーの蛍光寿命の低下である。この場合のFRETアクセプターは単一の分子ではなく、最初に機能的なFRETアクセプターフルオロフォアになるために生体内で再構成されるべき分割YFP BiFCペアであるため、三者間相互作用の場合の複雑さはさらに増加する。
FRET-FLIMを実施するには、ドナー分子蛍光寿命を最初に単独で決定し、次にFRETパートナーの存在下で決定する必要があります。FLIMアプリケーションを共焦点レーザー走査顕微鏡で開き、コンソールを起動し、パターン認識光子計を使用して蛍光寿命を測定します。標準の全フォトン計数測定モードを選択します。
2種類の農業浸潤植物を取ります。一方はCCFP遺伝子を有し、また、Mタンパク質の相互作用が既にBiFC及びY2Hを用いてCタンパク質と検証されているため、CCFP遺伝子を有する一方と共に、この相互作用ペアとのFRET効率が良好であると期待している。次に、まずCCFPの浸潤した葉をスキャンし、良好なCFP蛍光を示す細胞を探します。
顕微鏡の設定はスクリーンに表示される。サンプルは、パルス当たり約0.1光子を達成するのに十分なレーザーパワーで照らされます。蛍光強度の変動を有するサンプルについては、50フレームをキャプチャし、生涯測定に必要な適切な光子を収集します。
CFPは、その確認適応により2つの蛍光寿命を示すことが知られているので、Nの値を2に等しく保ちながら、指数関数的な再畳モデルを使用してデータを供給します。これらの設定では、2 つのライフタイムは 1 秒と 3.2 ナノ秒で表示されます。以降のすべての計算では、より高い寿命を使用します。
CCFP と MYFP の間でフレットを測定する設定になりました。このために、CCFPとMYFPで農業浸潤植物からの葉のサンプルを使用してみましょう。CCFPとMYFPの両方を表現するセルを探し、フル40ナノメートルパルスレーザーと514ナノメートルの白色光レーザーを使用してそれらを励起することによって、それぞれの発光パターンを確認します。
その後、FLIM コンソールに切り替えて、CCFP の寿命を測定するために以前使用したのと同じ設定を使用して CFP の有効期間を測定します。しかし今回は、CCFPと相互作用し、CCFPの寿命を低下させる可能性のあるMYFPもセルに発現しています。N指数再畳モデルNを2に等しくして得られたグラフを読んだので、実際にはCFPの寿命が3.2から2.6ナノ秒に減少しています。
ソフトウェアでFRETコンソールを起動し、ソフトウェアで提供される方程式に疑いのない寿命を手動で入力してFRET効率を計算し、観察されたFRET効率は56%になり、最後のステップに進み、3人のパートナー間の相互作用を視覚化します。このために、CCFPとMYFPNとMYFPCと共浸した植物から葉のサンプルを採取します。葉葉植物をスキャンして、2つのMタンパク質間の相互作用から発せられるCFPと再構成されたYFP蛍光の両方を示す細胞を探します。
我々は、以前に使用したのと同じレーザーと発光波長を使用しています。その後、514ナノメートルレーザーの電源を切り、FLIMコンソールに移動します。MYFP ダイマーが CCFP と相互作用する場合。
MYFP との相互作用の間に観察された CCFP の寿命が減少するはずです。しかし、CCFPがMYFPダイマーと相互作用しない場合、その蛍光寿命は3.2ナノ秒で見られるはずです。上記のような設定を用いて、再構成されたYFPの存在下でCFP寿命を測定する。
2 に等しい N 指数再畳モデルを使用してグラフを適合し、FRET コンソールに移動します。そして、はい、CFPの寿命は3.2から2.3ナノ秒に減少しています。上記のFRET効率を算出する。
ここで計算されたFRET効率は、FRETアクセクサの存在と不在におけるFRETドナーパートナーの蛍光寿命を測定するためにFLIMを使用しました。2つのタンパク質間に陽性の相互作用がある場合、ドナーの蛍光寿命の低下が予想された。正のコントロールの場合、それはCCFPとMYFPです。
我々は、ドナーの蛍光寿命を3.3から2.5ナノ秒に減少させ、FRET効率は再構成されたYFPと同様の運動であった56%Aであり、2つのアモノマーとCタンパク質の相互作用から生じる肯定的なFRET相互作用もまた、ドナーの蛍光寿命を2.6ナノ秒に減少させる陽性FRET相互作用をもたらした。この場合、計算されたFRET効率は約55%であった。FRETドナーの蛍光寿命の減少は、これらのタンパク質間の三者間相互作用の強力な証拠を提供する。
ここで説明するプロトコルは、生きている細胞における三者タンパク質とタンパク質の相互作用を決定するための強力なツールです。この手順はまた、結果として得られた複合体の細胞内局在化を決定するのに役立ちます, これは、任意のタンパク質複合体の機能および生理学的意義を解読する上で重要である.結論として、BiFCベースのFRET-FLIMアッセイは、三者タンパク質相互作用の重要な側面を研究し、特徴付ける機会を提供し、動物および植物系の両方でタンパク質とタンパク質相互作用の研究に役立ちます。
