アポトーシス開始は、マーカー分子プラットフォームでのカスパーゼの活性化によって媒介される。カスパーゼ8活性化のプラットフォームとなる重要な開始細胞死複合体DISCの検出を提示する。この技術の利点は、この複合体におけるcaspase-8処理に関する情報を提供するとともに、アセンブリおよびDISC複合体の組成の検出を可能にすることです。
80%〜90%コンフルエントで、皿に付着した細胞で実験を開始します。培地を捨て、接着細胞に新鮮な培地を加えます。次に、プレートを斜めに保持し、接着細胞に触れることなくリガンドを培地にピペット処理することで、選択したCD95L濃度で細胞を刺激します。
細胞を収穫するには、氷の上に細胞皿を置きます。細胞懸濁液に冷たいPBSの10ミリリットルを加え、取り付けた細胞をプレートから削り取ります。50ミリリットルチューブに細胞懸濁液を集める。
冷たいPBSの10ミリリットルで細胞皿を2回洗い、同じ50ミリリットルのチューブに洗浄液を加えます。その後、セル懸濁液を摂氏4度で5分間500倍Gで遠心分離する。上清を捨て、冷たいPBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。
その後、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。細胞懸濁液を遠心分離し、再び冷たいPBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。遠心分離をもう一度繰り返し、細胞ペレットを1ミリリットルのリシスバッファーで再懸濁し、氷の上で30分間インキュベートします。
インキュベーション後、最大速度でリセートを摂氏4度で15分間遠心し、上清をきれいなチューブに移します。ペレットを捨てて、タンパク質濃度を決定するために、別のチューブにライセートの50マイクロリットルのサンプルを集めます。免疫沈降の場合、2マイクロリットルの抗APO1抗体と10マイクロリットルの調製プロテインAセファロースビーズをライセートに添加します。
ビーズの10マイクロリットルを、ビーズコントロールとして機能するリゼートを含む別のチューブに単独で加えます。リゼート、抗体、タンパク質Aセファローズビーズを含む混合物を穏やかな混合で摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、500倍Gで摂氏4度で4分間遠心する。
上清を捨て、冷たいPBSを1ミリリットル加えてビーズを洗浄し、遠心分離後に上清を捨てます。この手順を少なくとも 3 回繰り返します。最後のPBS洗浄を廃棄した後、好ましくは50マイクロリットルのハミルトンシリンジでビーズを吸引する。
ウエスタンブロットを実行するには、ビーズに20マイクロリットルの4Xローディングバッファを加え、摂氏95度で10分間加熱します。同時に、95°Cで5分間、lysateコントロールを加熱します。ライセート、免疫沈降剤、およびタンパク質標準物を12.5%SDSゲルにロードし、一定電圧80ボルトで動作します。
ゲルの実行が完了したら、SDSゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を移します。移管が完了したら、ブロット膜を箱に入れ、穏やかな攪拌の下でブロッキング溶液に1時間インキュベートし、PBSTで5分間膜を3回洗浄します。タンパク質を検出するには、示された希釈液で最初の一次抗体を膜に加え、穏やかな攪拌で摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、膜を5分間のPBST洗浄を3回洗浄し、20ミリリットルの二次抗体で膜を室温で1時間穏やかに揺らしてインキュベートします。再びPBSTで膜を3回洗います。最後のPBST洗浄を廃棄した後、約1ミリリットルの西洋ワサビペルオキシダーゼ基板を膜に加え、化学発光シグナルを検出します。
CD95Lによる子宮頸癌HeLa-CD95細胞の刺激は、CD95免疫沈降を介して監視される高レベルのCD95 DISC形成をもたらした。CD95、FADD、プロカスパス-8、プロアスパス-10、およびc-フリップは、効率的なDISC形成を示すこれらのCD95免疫沈降法において観察された。p43-FLIPおよびp22-FLIPの切断産物は、カスパーゼ-8活性化を示す免疫沈降で検出された。
C-FLIPを過剰発現するHeLa-CD95細胞をCD95 DISC形成の解析に用いた。親のHeLa-CD95細胞と同様に、FADD、プロカスパス-9、プロアスパス-10、c-FLIPタンパク質、およびPARP1の募集は、CD95L治療なしでこれらの細胞からの免疫沈降法で検出されなかった。活性化された一次T細胞は、抗CD95免疫沈降においてCD95、FADD、プロスパパス-8、プロアスパス-10、およびc-FLIPSの高レベルを特徴とした。
この技術は、DISCでのカスパーゼ-8の処理を含む、分子DISC形成の解析を可能にする。すべての洗浄ステップは非常に重要です。また、刺激ポイントとインキュベーション時間は真剣に取り組むべきです。
これは DISC 複合体上のアセンブリを測定する唯一の方法です。しかし、カスパーゼ8活性化を測定するために、カスパーゼ-8活性アッセイを実施することもできる。このアプローチは、アポトーシス開始に関する新しい洞察を得ることを可能にしました。
