したがって、このプロトコルは、TDP-43の病理学的相転移を誘導し、ALSで運動ニューロンが退化する理由を理解するのに関連する生体内の脊髄運動ニューロンにおける細胞の結果に対処することを可能にする。ゼブラフィッシュの幼虫の透明度が高いため、脊髄の運動ニューロンは直接見えます。したがって、単一の脊髄運動ニューロンで相転移を起こしているTDP-43の動的挙動を視覚化することができます。
この方法はALSの新しい動物モデルを提供する。このALSモデルにおいて、光誘導TDP-43相転移と凝集を防ぐことができる方法は、ALS療法の候補となる可能性があると考えています。本質的に障害領域を有する他のALS関連タンパク質は、異常な相転移に関連する神経毒性を探索するために発現することができる。
このアプローチで成功するための鍵は、非毒性レベルで脊髄運動ニューロンで光遺伝学的TDP-43を発現することです。BACトランスジェネシスは時間のかかるステップですが、適切なトランスジェニック魚を作成すると、次のステップは比較的簡単で簡単です。まず、タブレットまたは電話機にインストールされている関連アプリケーションを使用して、発光ダイオード(LEDパネル)をオンにします。
次に、分光計プローブを6ウェル皿の空の井戸に入れます。次に、アプリケーションを使用して、456 nmでピークを迎える波長にLED光を調整します。空の井戸に光学パワーメーターの光学センサーを置き、LEDライトの電力を調整します。
その後、28 C.でLEDパネル設定をインキュベーターに置き、光遺伝学的TDP-43を発現するシマウマの魚の幼虫をイメージングし、二重トランスジェニック魚をデコールニオンし、トリカンの250 g/mLを含むE3バッファーに麻酔をします。次に、42°Cでエチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩250g/mLを含む1%低融点アガロースを予熱し、ガラスベースディッシュにアガロースを滴下する。ガラス皿のドーム状のアガロースの落下の直径は8〜10mmでなければなりません。
次に、パスツールピペットを使用して、ガラスベースの皿のアガロースに麻酔魚を追加します。魚と一緒にアガロースに添加E3バッファーの量を最小限に抑えます.その後、数回ピペットで混ぜます。
アガロースの固化時に、脊髄が適切な水平位置になるように、注射針を用いて魚を横に維持する。アガロースが固まった後、ドーム型のアガロースに取り付けられた魚にE3バッファーのカップル滴を追加します。20回の水浸し対物レンズを搭載した共焦点顕微鏡を使用して、脊髄の連続共焦点zセクションを取得します。
ポイント全体の脊髄セグメントを識別し、比較するための参照として、関心のある領域の魚の腹側のクロアカを含めます。イメージングが完了するとすぐに注射針を使用して慎重にアガロースを割り、アガロースから魚を取り除きます。アガロース埋め込み30分未満は魚の生存率に影響を与えませんが、魚がアガロースに埋め込まれる時間をできるだけ短くしてください。
6ウェル皿の1つの井戸にE3バッファの7.5 mLを追加し、その井戸に画像の二重トランスジェニック魚を置きます。次に、皿をLEDパネルに置き、皿とLEDパネルをスペーサーで5mm離したまま、青いLEDライトを点灯します。照らされていないコントロールフィッシュのためのアルミ箔で覆われた別の6ウェル皿にいくつかの二重トランスジェニック魚を保ちます。
所望の照射時間の後、先に示したように、照射された魚の脊髄をイメージした。単一の脊髄運動ニューロンにおけるopTDP-43hの細胞質移動は、48で取得したzシリーズ画像を分離することによって可視化された。各EGFP-TDP-43zおよびopTDP-43hチャネルへの受精後72時間。
EGFP-TDP-43zの最大強度投影画像から、両方の48で識別可能な単一の単一の脊髄ニューロン。受精後72時間が選択された。運動ニューロンのソマをカバーする関心のある領域は、48でEGFP信号の端をトレースすることによって設定された。
そして受精後72時間。相馬の長軸に沿って正規化された蛍光強度をプロットした。そして、受精後48時間で、両方の信号のパターンが大きく重なっていました。
これに対し、72時間で、eGFP-TDP-43zシグナルが低い領域でopTDP-43hシグナルのピークが見つかり、opTDP-43hの細胞質再配置を示す。青色光刺激前後のopTDP-43hおよびEGFP-TDP-43z信号を定量化するために、同じzシリーズ画像の各チャンネルの一部のスライス投影画像が48で生成されました。そして受精後72時間。
調査した4つのmnr2b+細胞のうち、セル1は、特に飽和EGFP-TDP-43zシグナルを示した。EGFP-TDP-43zに対するopTDP-43hの相対量は、RFP値をGFP値で割って算出した。セル2~4は、青色光照射後のopTDP-43h濃度の低下を示した。
魚が健康を保つためにアガロースに埋め込まれる時間を最小限に抑えることが重要です。LED照明の強度と持続時間を調整することにより、一時的に調節された方法でTDP-43相転移を制御し、運動ニューロンにおける病理学的TDP-43相転移の進行を解剖するのに役立ちます。
