我々は、レーザーが設定挙動実験とDPSSについてのアドバイスをふみ久保トッドティエルとHerwigBaier校（UCSF /マックス·プランク研究所）に感謝、シェフtdTomato実験を補助するためのMBL神経生物学コースからHeesooキムとキアラCerri; PetronellaKettunen（ヨーテボリ大学）初期optogenetic実験のコラボレーションのために、BaljitKhakh、エリック·ハドソン、マイクバカと技術的なアドバイスのためにジョン·ミリガン校（UCLA）、そしてシェフtdTomato用ロジャーツィン校（UCSD）の構築。 ASへ：この作品はAMSPとNSFからの助成金にNRSA（5F31NS064817）賞（0819010 RIG）によってサポートされていました。

前もって次の準備をします。 1。ファイバケーブルを準備<ol><li> 〜150°の角度を作成するにはブンゼンバーナーの上にガラスパスツールピペットのテーパー首を溶融することによって光ファイバケーブル用のストレージユニットを作成します。 </li><li>ワイヤカッターまたはカミソリの刃を使用して、慎重に二つにファイバーケーブルを切断してください。それぞれの作品は、FC / PCアダプタと1露出端に一端があるはずです。予備ケーブルとして1つの作品を保管してください。 </li><li>ケーブルの切断端の5.0 cmから繊維ジャケットと強化繊維（ 図1A）を除去して被覆管に光ファイバケーブルをストリップ。 </li><li>準備されたパスツールピペットに光ファイバーケーブルを挿入します。ケーブルは簡単に​​ピペットチップの内外に移動できることを確認します。 </li><li>光ファイバケーブルは、パスツールピペットの先端から突出して、慎重に切断端から約2mm、ガラス繊維の周囲から光ファイバのクラッドをカットし、削除します。 </li><li>ダイヤモンドペン/ガラスカッター、ニックガラス繊維とブレークoを使用してffはエンドファイバ（ 図1B）の終わりにきれいにカット/サーフェスを作成する。 </li><li>ストレージにパスツールピペットに光ファイバケーブルを収納してください。光ファイバーの先端が不規則に欠けたり休憩される場合は、手順（1.6）を繰り返します。 </li><li>マイクロマニピュレータを用いたパスツールピペットの位置ファイバケーブル（ 図1C）。 </li></ol>手順2-8は、多くのゼブラフィッシュの実験に一般的に適用可能な胚に導入遺伝子を注入する方法を説明します。この方法のバリエーションには、他のJoveのビデオ6、7、8、9に記載のものと同様に、22は同等に有効である。 2。注射針を引っ張る<ol><li>ニードルプラーを使用して、徐々に先細チップで2注射針にホウケイ酸ガラスチューブを引き出します。プーラーの設定が異なります。 （サターインスツルメンツニードルプラーで私達は設定を使用して、P = 500、ヒート= 720、= 50、速度を引き出し= 70時間= 150）。すべての針プラーのでemがプーラーの設定を最適化し、異なっているpirically。もっとテーパー針については、熱および/またはプルを増やします。少ないテーパー針については、時間および/または減少プルを増やす。 </li><li>安全な容器に入れ針（ すなわち圧延テープ付きペトリ皿、粘着面アウト）。 </li></ol> 3。射出成形金型を注ぐ<ol><li>アガロースが完全に溶解するまで、30ミリリットルの胚/青い水に0.5グラムアガロースを溶かす。 </li><li>シャーレの下半分に注ぐ。 </li><li>井戸の周りに気泡形成を制限するように注意して、アガロースに井戸（ 図2）を搭載したある場所長方形のモールド。 </li><li>アガロースを固化することができます。 </li><li>金型を外し、青/胚水でシャーレを埋める。 </li><li>直立して格納し、同じ日の使用のために室温で、または4℃で将来の使用のために、きれいな水で満たされた。 </li></ol> 4。注射用プラスミドDNAのミックスを作る<ol><li>蒸留H 2 O中で1:10フェノールレッドでた50 ng /μlの濃度にプラスミドDNAを希釈のために例： <table border="1"><tbody><tr><td> 1.0ミリリットル</td><td>プラスミドDNA（250 ng / ml）を</td></tr><tr><td> 0.5ミリリットル</td><td>フェノールレッド</td></tr><tr><td> 3.5ミリリットル</td><td> ddH 2 Oを</td></tr></tbody></table></li><li>数日間のために直ちに使用するか、4℃で保存した場合、DNAの混合物を室温に保つことができる。 </li></ol> 5。嵌合ペアを設定あなたが注射を行うことを計画する前に、これは夕方に行う必要があります。 <ol><li>システムの水で繁殖タンクを記入し、オスとメスの魚を一緒に配置します。ライトは分圧器を使用して、施設内の別のオスとメスの魚を上に回すと、注射はできるだけ早く行うことができない場合。 </li></ol> 6。 （胚を待っている間に行うことができます）注射の準備をする<ol><li>圧力インジェクタリグの電源をオンにします。システムはパルスに設定されていることを確認します。 1に設定し、パルス持続時間で始まります。 </li><li>空気弁の電源をオンにして、〜20 psiにインジェクタに圧力を調整します。 </li><li>最高倍率で解剖スコープを使用して、鉗子や〜2μmの開口部（ 図3、ムービー1）を作成するために火かき棒で針の先端を破る。 </li><li>によりDNAミックスで針を埋める：1。 DNAのミックスに、針、先端側を上に置くと針が毛細管現象または2で記入させる。 DNAの1から2μlのピペットに長距離チップを使用すると、針に直接混ぜる。 </li><li>注入する準備が整うまでは、安全な場所に埋め針を置きます。 </li></ol> 7。胚を収集<ol><li>施設のライトがオンになった後、仕切り板（該当する場合）を削除します。ストレーナー/小さなふるいで胚を採取し、新鮮な青/胚水でシャーレに移す。 </li></ol> 8。 1から2細胞期胚を注入<ol><li>プラスチック製のピペットを用いて射出成形金型に収穫胚を転送します。 </li><li>解剖顕微鏡を使って、そっと中に胚をプッシュ鉗子または鈍いポーカーのウェル（ 図4、ムービー2）。 </li><li>胚オーバーマイクロマニピュレータと位置にロードされた針を置きます。 </li><li>希望の音量（〜1 NL）を達成するまで、1ステップ単位でパルス幅を調整することにより、注入量のキャリブレーションを行います。これは、前のJoveのビデオ8、22で説明したように、マイクロスライドでキャリブレーションが、注入量の広い範囲が適切な表現になりますので、この実験の精度のために、必要ではないということです。 </li><li> 〜1 nlのDNAはすべての胚の細胞とリピートに直接混ぜて注入する。 DNAはまた、卵黄に注入しますが、これは（ 図5、ムービー3）効率が悪くなる傾向にあることができます。 </li><li>青/胚水の穏やかな流れを使用して金型から注入された胚を取り出します。 </li><li>ストアは、暗闇の中で28.5℃で胚を注入した。 </li><li>定期的に未受精卵、損傷または死亡胚を取り出します。 </li><li>胚wiを扱う色素沈着を防ぐために18から24の間にHPF番目PTU。 </li></ol> 9。導入遺伝子発現のための画面<ol><li>鉗子を使用して手動でdechorionate 24から48 HPFの胚。 </li><li> tricaine 0.02％を使用して幼虫を麻酔。 </li><li>蛍光解剖顕微鏡を用いて、RBまたは三叉神経細胞の発現と幼虫を識別し、新鮮なPTUの青/胚水で新しい皿にこれらを転送します。容易に識別できる細胞内のスパース表現した胚は最適ですが、表現の密度の広い範囲が許容されるので、個々のニューロンは、光ファイバケーブルを使用してアクティベーションの対象となります。 </li><li>ストア胚28.5、暗所で℃の希望の実験段階まで。 </li></ol> 10。行動実験のための幼虫をマウント<ol><li>蒸留H 2 Oおよび固化からそれを防ぐために、42℃のヒートブロックでストアに1.5％低融点アガロースを加えます。 </li><li>浴槽にガラスパスツールピペット、転送事前にスクリーニングした幼虫のいずれかを使用しできるだけ少ない青/胚水で1.5％低融点アガロースのe。 </li><li>小さなシャーレ上にアガロースのドロップで幼虫を転送します。 </li><li>解剖顕微鏡下では、位置の幼虫の背側のアップ。 </li><li>アガロースが固化したとき、全体の幼虫の周りに寒天のくさびを残して、薄いカミソリの刃（＃11メス）でアガロースを切り取った。 </li><li>卵黄の両側に二つの対角線カットを作る;ニックネームに幼虫の世話をしないでください。 </li><li>胚/青い水でアガロースを囲む領域を塗りつぶします。 </li><li>幼虫の体幹と尾（ 図6）からアガロースを引き離す。 </li></ol> 11。ハイスピー​​ドカメラとイメージングソフトウェアを準備<ol><li>スコープを解剖に高速度カメラをマウントします。 </li><li>カメラをパソコンに接続する。 </li><li>コンピュータの電源を入れます。 </li><li>高速度カメラの電源をオンにします。 </li><li>オープンなビデオ/イメージングソフトウェア（我々は、AOSのイメージングソフトウェアを使用し、ここでそれを使用するための手順を説明しますが、他のイメージングソフトウェア）は等しく許容されます。 </li><li>それに応じてカメラの設定を調整します（1秒当たりすなわち千フレーム（fps）、50％トリガバッファやその他の設定を設定します）。 </li><li>記録を開始します。 </li></ol> 12。 473 nmのレーザーを使用した単一ニューロンを活性化する<ol><li>刺激装置、レーザーと光ファイバケーブルを接続します。 </li><li>刺激装置の電源をオンにします。 </li><li> 5ボルトの最大値と5ミリ秒のパルス幅に刺激を設定します。 </li><li>製造元の指示に従って、レーザーをオンにします。 </li><li> CHEF-tdTomato発現（ 図6）とニューロンの細胞体の近くに光ファイバケーブルの先端を配置するために解剖顕微鏡を使用しています。 </li><li>感覚ニューロンを活性化するために、青色光のパルスを実現します。 </li><li>高速度カメラを使用してレコードの動作が秒当たり500または1,000フレームに設定。 </li><li>馴化を避けるために、各アクティベーション間の1分待って、必要に応じて実験を繰り返す。 （我々は、各ニューロンのための3つの応答の最小値を記録）。 </li><li>へリリースの幼虫は、動物を傷つけないように注意しながら、鉗子でアガロースをこじ開ける。この動物は、さらに発展させることができると手順は、行動の発達を特徴づけるために古い段階で繰り返すことができます。胚はまた後述するように、細胞の構造と動作を相関させるための活性化細胞の高分解能共焦点イメージングのために再マウントすることができます。 </li><li>新鮮な青/胚水で培養プレートに幼虫を移す。我々は個々の幼虫を追跡するために、24ウェルプレートを使用してください。 </li></ol> 13。共焦点レーザ顕微鏡を用いた画像ニューロン（S） <ol><li> 0.02パーセントtricaineで幼虫を麻酔。 </li><li> 1.2パーセント低融点アガロースでまたは背型の台紙の幼虫、最大背側、。 </li><li>画像シェフtdTomato 543 nmのレーザー、適切なフィルタとを目的としたニューロン。我々は20倍対物レンズを使用しています。 </li><li>アガロースから幼虫を取り出して、青/胚水でよく個々に戻ります。 </li><li> 28.5℃で保存fuが暗闇の中で、Crther分析。 </li></ol>

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	<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin.">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li><li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish.">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li><li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+elicited+by+single,+channelrhodopsin-2-evoked+spikes+in+zebrafish+somatosensory+neurons.">Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons.</a> Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).</li><li>Downes, G. B., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supraspinal+input+is+dispensable+to+generate+glycine-mediated+locomotive+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).</li><li>Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+locomotor+network+in+zebrafish.">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish.">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).</li><li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences.">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Chimeric+Zebrafish+Embryos+by+Transplantation.">Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Kohashi, T., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Mauthner-+or+non-Mauthner-mediated+fast+escape+evoked+by+different+modes+of+sensory+input.">Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input.</a> J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy.">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Liu, K. S., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablations+reveal+functional+relationships+of+segmental+hindbrain+neurons+in+zebrafish.">Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish.</a> Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).</li><li>Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+startle+motor+patterns+and+behaviors+in+the+larval+zebrafish+(Danio+rerio).">Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).</li><li>Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+reporters+identify+somatosensory+neuron+subtypes+in+larval+zebrafish.">New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. , (2012).</li><li>Pujol-Mart&#237;, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., L&#243;pez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+birth+order+identifies+a+dimorphic+sensorineural+map.">Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map.</a> J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li><li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression.">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li><li>Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord.">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li></ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないことを宣言します。

我々は、ゼブラフィッシュのライブで単一のRBニューロンのoptogenetic活性化するためのアプローチを説明してきました。我々の方法は、特定の体性感覚ニューロンに蛍光標識channelrhodopsinバリアント、CHEF-tdTomato 13を発現する一過性遺伝子導入を採用しています。このアプローチは、簡単に他の幼虫のゼブラフィッシュの細胞集団での使用に適合させることができた。 <p class="jove_conten...

光の波長と定義されている神経細胞の興奮性を促進または阻害するためoptogenetic方法の開発は、それが可能な行動1、19、21を制御する神経回路のニューロンの異なる集団の機能を研究するために作られました。この技法はしばしばニューロンのグループをアクティブにするために使用されますが、それはまた、個々の神経細胞を活性化するために使用することができます。彼らは半透明であるため、ゼブラフィッシュの幼虫はこれらの方法に特に適している、彼らの神経系はすぐに開発し、トランスジェニック動物を作成することは、迅速かつルーチンです。しかし、重要な技術的ハードルは確実に単一ニューロンの活性化を実現するために克服しなければならない。 シングルゼブラニューロンのoptogenetic活性化のための手順を最適化するために、私たちは体性感覚ニューロンに焦点を当てた。頭を支配する三叉神経ニューロン、およびRohon·ビアード（：ゼブラフィッシュの幼虫は、2つのニューロンの集団を用いて体性感覚刺激の様々な検出RB）の本体の残りの部分を支配するニューロン。各三叉とRBニューロンは皮膚の広範囲に枝が刺激と下流の神経回路に接続する中央の軸索を検出するために末梢軸索を投射する。動物は、コヒーレント性感覚回路5、18を形成していることを示す、21時間後の受精（HPF）には早くもタッチに反応。幼虫の発育中に少なくともマウスナー細胞上にいくつかの三叉神経とRBニューロンのシナプスは、古典的なエスケープ応答を活性化しますが、エビデンスが蓄積され逃避行動2、4のバリエーションを引き出すことができる接続のさまざまなパターンを持つ体性感覚ニューロンの複数のクラスがあることを示唆する10、12、14、15、16、17。この方法を開発するための私たちの動機は、体性感覚ニューロンの異なるクラスの行動機能を特徴づけることであったが、この方法は、原理的にはLARのニューロンのほぼすべてのニューロンまたは人口の機能を研究するために使用することができるvalのゼブラフィッシュ。 ダグラスらは、以前に逃避行動を誘発する3、青色光チャネルロドプシン-2発現性感覚ニューロンを活性化するための方法を記載した。彼らのアプローチは、体性感覚ニューロンでChR2-EYFPの発現を駆動するためにISL1遺伝子からエンハンサー要素を使用していました。この導入遺伝子は、しかし、ChR2-EYFPを発現する細胞の可視化を可能にするために第二のレポーター、UAS :: GFPの同時注入を必要とする、比較的弱い蛍光を表示することが報告された。このアプローチは、24から48の間にHPF行動応答を誘発するために使用されましたが、72 HPF過去の応答を引き出すことができませんでした。この方法は非常に早い幼生期（24〜48 HPF）で神経回路を研究するために動作しつつ、それは、より多様な行動反応は明らかであり、神経回路は、より成熟している年上の幼虫の神経回路と行動反応を特徴づけるには不十分である。 我々はしようとした幼虫のRBのニューロンの亜集団の機能を特徴付けるために、この技術の感度を向上させる。発現を改善するために我々は蛍光標識された光によって活性化されたチャネルの発現を増幅するためのLexA-VP16とのLexAオペレーター配列のストレッチ（4xLexAop）11の発現を駆動するために体性感覚的エンハンサー（CREST3）20を使用していました 。この構成では、第二のレポーターを共発現し、私たちは直接、各ニューロンのチャンネルの相対量を判断できるようにすることの必要性を排除し、チャネルの発現を増幅した。のLexA / LexAopシーケンスを使用することで、Gal4/UASシステムを使用してゼブラフィッシュレポーターラインに導入遺伝子を導入することを可能にするという付加的な利点を持っていた。この導入遺伝子の一過性発現は、発現のレベルを変化させた結果が、通常は数日間にわたって細胞体および個々のニューロンの軸索突起の両方を視覚化することは十分に堅調に推移しました。感度を最適化するには明るみにITY我々はチャネルシェフ、ヘリックスループEF 13でクロスサイトのchannelopsin-1（Chop1）とchannelopsin-2（CHOP2）のキメラから成るchannelrhodopsin変異体を活性化する光を使用していました。このチャネルは、ChR2と同じ波長で活性化しますが、ChR2を含む他の一般的に使用されるチャネル、よりそれがより敏感になるため、活性化のためのより低い光強度を必要としている。シェフのタンパク質は、私たちがチャネルをアクティブにせずにタンパク質の発現をスクリーニングできるように、赤色蛍光タンパク質、tdTomatoに融合させた。光源として、我々はダイオードが幼虫の特定の領域に青色光の正確な、ハイパワーパルスを供給するように、光ファイバケーブルに結合固体（DPSS）レーザ励起に使用。これは、私たちは単一ニューロンにおけるチャネルを発現している稀なトランスジェニック動物を見つけるための必要性を排除し、個々のニューロンにレーザ光の焦点を合わせることができました。このアプローチを使用して、我々は、単一のRBのニューロンを活性化する行動反応を記録することができました高速度ビデオカメラ、および画像共焦点顕微鏡による高分解能で活性化されたニューロンの。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 材料 </td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 1367820B </td><td>または同等の（10-15 mm径） </td></tr><tr><td> 200μmの光ファイバー</td><td> ThorLabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td>パッチコード、長さ：3 mは、END：FC / PC、端部B：FC / PC、ジャケット：FT030 </td></tr><tr><td> 50μmの光ファイバ</td><td> ThorLabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td>パッチコード、長さ：3 mは、END：FC / PC、端部B：FC / PC、ジャケット：FT030 </td></tr><tr><td>調節可能なストリッピングツール</td><td> ThorLabs </td><td> AFS900 </td><td>または3ホールストリッピングツール（FTS4） </td></tr><tr><td>ダイヤモンドウェッジスクライブ</td><td> ThorLabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> /ブラウンマイクロピペットプラー燃える</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> P-97 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>フィラメントとホウケイ酸ガラスチューブ</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> BF-100-78から10 </td><td></td></tr><tr><td>射出成形金型</td><td> N / A </td><td> N / A </td><td>図5 </td></tr><tr><td> 1.5 mlの遠心管</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿（100x15 mm）の</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿（60x15 mm）の</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>圧力インジェクタ</td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>マニピュレーターと金属スタンド</td><td>持てる</td><td> M152 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>使い捨てのプラスチックピペット</td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ポーカー（ピンホルダーと昆虫ピン） </td><td>ファイン科学ツール株式会社</td><td> 26018から17と26000から70 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファイン科学ツール株式会社</td><td> 11255から20 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> Microloaderピペットチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28.5℃のインキュベーター</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td> 42℃のヒートブロック</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td>非滅菌メスブレード＃11 </td><td>ファイン科学ツール株式会社</td><td> 10011から00 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> sを解剖対処</td><td>ツァイス</td><td> STEMI </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>標準フィルタと蛍光解剖スコープ</td><td>任意の</td><td>任意の</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> LSMは510または710 </td><td>またはGFPおよびRFP、及び10倍、20倍と40倍の目標を達成するためのレーザーと同等の</td></tr><tr><td>ハイスピー​​ドカメラ</td><td> AOSテクノロジーズ株式会社</td><td> X-PRI（130025から10） </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> 473 nmのポータブルレーザー</td><td>結晶レーザー</td><td> CL-473から050 </td><td> TTLオプション付きまたは高電力、 </td></tr><tr><td> S48スティミュレータ</td><td>アストロメッド株式会社草音源部門</td><td> S48K </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> FC / FC / PC交配スリーブへのPC </td><td> ThorLabs </td><td> ADAFC1 </td><td>月ねファイバケーブルの接続を行うために、ed </td></tr><tr><td>レーザー安全メガネ</td><td> ThorLabs </td><td> LG10 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> 24培養プレート</td><td>ジェネシー川</td><td> 25から102 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>シングルうつ病スライド</td><td>フィッシャー</td><td> S175201 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td>インスタント海</td><td>水生生態系</td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>フィッシャー</td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>シグマ</td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>シグマ</td><td> A9045 </td> &lt;TD&gt;または同等</td></tr><tr><td> PTU </td><td>シグマ</td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td>シグマ</td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td>青/胚水</td><td></td><td></td><td> 10Lの蒸留H 2 O 0.6グラムインスタントオーシャン 6滴メチレンブルー</td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td></td><td></td><td> （0.2MのKCl、5 mg / ml）を</td></tr><tr><td> 100xのPTU </td><td></td><td></td><td> 0.150グラムPTU 50ミリリットルddH 2 Oを 70で溶解℃、頻繁に振る -20℃でアリコートとストア</td></tr><tr><td> 1X PTU </td><td></td><td></td><td> 1ミリリットル100xのPTU 99ミリリットル/青魚の水</td></tr><tr><td> Tricaine原液</td><td></td><td></td><td> 400mgのtricaine 97.9 ddH 2 Oを</td></tr><tr><td> 〜2.1ミリリットル1Mトリス、pH9.0 </td><td></td><td></td> &lt;TD&gt;〜pHを7.0に調整 長期保存のため4℃または-20℃に保管して</td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

ゼブラフィッシュ幼生は単純な神経回路の発達と機能を記述するためのモデルとして浮上している。彼らの体外受精、急速な発展、および透明度のために、ゼブラフィッシュは、特に神経回路機能を調べるためにoptogeneticのアプローチに適しています。このアプローチでは、光感受性イオンチャネルを活性化または阻害するそれらの意志で、したがって、特定の行動への貢献を評価するための実験を​​可能にし、特定の神経細胞で発現されています。幼虫のゼブラフィッシュでこれらの方法を適用することは、概念的には単純ですが、技術的な詳細の最適化が必要です。ここでは、ゼブラフィッシュ幼生体性感覚ニューロン、写真活性化単一細胞でchannelrhodopsin変異体を発現させ、その結果の行動を記録するための手順を示しています。以前に確立された方法にいくつかの変更を導入することによって、このアプローチは、最大活性化する単一ニューロンから行動応答を誘発するために使用することができる少なくとも4日後に受精（DPF）へ。具体的には、タグ付けされたchannelrhodopsinバリアント、CHEF-tdTomatoの発現を駆動するために体性感覚ニューロンエンハンサー、CREST3を使用して導入遺伝子を作成しました。共焦点顕微鏡で画像化することができる体性感覚ニューロンにおけるモザイク式、1細胞期胚の結果にこの導入遺伝子を注入する。照明は、光ファイバケーブルを介して導かれ、473 nmのDPSSレーザーからの光を用いて、これらの動物で細胞を同定し、高速度ビデオカメラで記録し、定量的に分析することができる行動を誘発する。この手法は、任意のゼブラフィッシュの神経細胞を活性化することによって誘発行動を研究するために適合させることができた。遺伝的または薬理学的摂動にこのアプローチを組み合わせることで、回路形成と機能を調べるための強力な手段となります。

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。ファイバケーブルは、設置した。光ファイバケーブルの（A）のレイヤー。パスツールピペット（B）中の剥奪光ファイバケーブル。 （C）をパスツールピペットでの光ファイバケーブルは、マイクロマニピュレーターを使用して配置。 <img src="/files...

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Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenetic技術は、それが可能動作に固有ニューロンの寄与を研究するために作られました。我々は高速ビデオカメラを用いて行動を誘発したダイオード励起固体（DPSS）レーザーと記録とchannelrhodopsin変異体を発現する単一性感覚ニューロンを活性化させるための幼虫のゼブラフィッシュの方法（シェフ）を記述する。

CHEF-tdTomatoを使用してゼブラフィッシュ体性感覚ニューロンのOptogeneticアクティベーション

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

optogenetic-activation-zebrafish-somatosensory-neurons-using-chef

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K ビュー.  University of California, Los Angeles. Optogenetic技術は、それが可能動作に固有ニューロンの寄与を研究するために作られました。我々は高速ビデオカメラを用いて行動を誘発したダイオード励起固体（DPSS）レーザーと記録とchannelrhodopsin変異体を発現する単一性感覚ニューロンを活性化させるための幼虫のゼブラフィッシュの方法（シェフ）を記述する。

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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

組み合わせることを使用してターゲットと嗅球の神経細胞インビボでのエレクトロポレーションとGAL4ベースエンハンサートラップゼブラフィッシュの行

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

神経科学

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

ニューロンの光刺激のために手ごろな価格のLEDアレイを使用する

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

聴覚神経の光遺伝学的刺激

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of providing precise and controlled stimulation. This article introduces a technique for recording somatosensory event-related potentials (ERP) that uses a novel mechanical stimulation method involving skin deformation using a robotic device. Controlled deformation of the facial skin is used to modulate kinesthetic inputs through excitation of cutaneous mechanoreceptors. By combining somatosensory stimulation with electroencephalographic recording, somatosensory evoked responses can be successfully measured at the level of the cortex. Somatosensory stimulation can be combined with the stimulation of other sensory modalities to assess multisensory interactions. For speech, orofacial stimulation is combined with speech sound stimulation to assess the contribution of multi-sensory processing including the effects of timing differences. The ability to precisely control orofacial somatosensory stimulation during speech perception and speech production with ERP recording is an important tool that provides new insight into the neural organization and neural representations for speech.

This paper introduces a method for obtaining somatosensory event-related potentials following orofacial skin stretch stimulation. The current method can be used to evaluate the contribution of somatosensory afferents to both speech production and speech perception.

口腔顔面皮膚ストレッチ刺激から体性感覚事象関連電位

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

ゼブラフィッシュの再生モデルと網膜変性のレーザー誘起のミュラー グリア細胞の活性化

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

嗅覚ニューロンの光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を追跡

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...