私たちのプロトコルは、従来の蛍光顕微鏡を使用して多細胞スフェロイドの酸素化をイメージングするのに役立ちます。この方法を使用すると、何千もの酸素プローブ染色されたスフェロイドミクロ組織を生成し、その後3D印刷アプリケーションで使用することができます。例えば、血管新生骨組織移植片。
近赤外酸素プローブは、最終的に緑色蛍光染色などの他の色素の使用と互換性があり、これにより、ライブおよびマルチパラメータの長期分析が可能になります。マイクロパターン化されたPDMSスタンプを貯蔵バイアルから滅菌ペトリ皿に移し、滅菌層流気流条件下で滑らかな表面を上にして10分間空気乾燥させる。各スタンプを12穴滅菌組織培養プレートのウェルの中央に置く。
開いた蓋で1〜2分間空気乾燥させます。50ミリリットルの3%均質アガロース溶液を調製し、挿入されたPDMSスタンプを覆うために、12ウェルプレートの各ウェルに約2ミリリットルのホットアガロース溶液を直ちに加える。アガロースを滅菌気流下でインキュベートして20分間固化させる。
滅菌ヘラを使用して、埋め込まれたPDMSスタンプでアガロースを各ウェルに逆さまにします。スタンプの滑らかな上面に約200マイクロリットルの滅菌水を加えます。ヘラでアガロースから切り離し、井戸から取り除きます。
直接使用するために、対応する滅菌細胞培養培地をアガローススタンプに1ミリリットル加える。プレートを蓋で覆い、摂氏4度で一晩インキュベートします。使用前に、アガロースマイクロパターンプレートを二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で1時間温めます。
70%〜90%コンフルエント細胞培養物を予め加温したPBSですすいでください。解離酵素溶液を加え、摂氏37度で3〜5分間インキュベートする。その後、10%FBSを含む完全な細胞培養培地でトリプシンを中和する。
単一細胞懸濁液を得るために、血清学的ピペットの上部にある1,000マイクロリットルのピペットチップを用いて細胞凝集塊を解離させる。計数チャンバーを用いて、細胞懸濁液のミリリットル当たりの細胞数を計数する。細胞懸濁液を1ミリリットルあたり500,000細胞に希釈し、それに濃縮酸素プローブ溶液を加える。
12ウェルアガロースコーティング細胞培養プレートのマイクロパターン化されたウェルから古い培地を除去し、調製した細胞懸濁液をウェルに1ミリリットル加える。スフェロイドを二酸化炭素インキュベーター内で酸素プローブの連続存在下で2〜5日間培養し、スフェロイドの形成および圧縮中にスフェロイドが装填されていることを確認します。チップキャップで滅菌された3立方センチメートルのカートリッジの端を閉じ、ピペッティングによってバイオインクで充填する。
プランジャーをカートリッジに挿入し、逆さまに保持します。チップキャップを取り外し、カートリッジからの空気がすべて取り除かれるまでプランジャーをバイオインクの方に押し込みます。バイオプリンターの加熱マントル内のバイオインクを摂氏23度で冷却します。
バイオプリンターに70%エタノールをスプレーし、吸収紙で乾燥させます。カートリッジ上部の圧力アダプタをねじ込みます。カートリッジに22ゲージの円錐形ポリエチレン針を取り付けます。
カートリッジを押出成形プリントヘッドの加熱マントルに取り付けます。圧力インレットを差し込み、インレットのクリップを開きます。デザインのGコードファイルを印刷ソフトウェアにロードします。
針の長さ測定を開始します。滅菌したシャーレに少量のバイオインクを分配して印刷圧力を調整します。6ウェルプレートを取り付け、ウェルプレートを開き、フードを閉じて印刷します。
印刷後、足場を摂氏5度で10分間物理的に架橋させます。印刷した足場に紫外線LEDランプを60秒間照射します。二重抗生物質溶液を含む対応する成長培地を、バイオプリントされたグリッドを有するすべてのウェルに直ちに加える。
足場を二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で培養する。顕微鏡観察のために、印刷されたワッフルグリッドをイメージングメディアで顕微鏡の皿カバーに移します。1ミリリットルのピペットを使用して、アガロースマイクロウェルから予め染色されたスフェロイドの酸素プローブを静かに洗い流し、それらを15ミリリットルの円錐形底管に移します。
マイクロパターン化されたウェルからすべてのスフェロイドを確実に収集するには、追加の1ミリリットルの培養培地でウェルを1〜3回すすぎ、すべてのスフェロイド懸濁液を1つのバイアルに組み合わせます。バイアルを垂直に最大10分間放置して、回転楕円体が底に落ち着くようにします。回転楕円体を乱さないようにチューブからメディアを慎重に取り出します。
サンプルディッシュあたり少なくとも20個のスフェロイドに十分な新鮮な培養培地を加え、ピペッティングによってスフェロイドを穏やかに再懸濁する。直ちに等量の回転楕円体懸濁液を各プレコート顕微鏡観察ウェルに加える。回転楕円体を摂氏37度で1時間放置し、顕微鏡の表面によく付着させる。
顕微鏡から培地をウェルに取り出し、イメージングメディアで1回すすいでください。正確な量のイメージングメディアをサンプルに追加します。顕微鏡検査ステージ上に染色された回転楕円体で顕微鏡検査をうまくセットアップします。
10倍の倍率の対物レンズを使用して、透過光でサンプルをプレビューします。回転楕円体に予備的に焦点を合わせ、それらを画像の中心に配置し、必要な高倍率の対物レンズを作業位置に持って行きます。回転楕円体の赤道断面における透過光モードに焦点を合わせます。
酸素プローブの基準スペクトルチャネルおよび高感度スペクトルチャネルの蛍光またはリン光シグナルを収集するための設定を調整し、イメージングプロセスを開始します。参照チャンネルと高感度スペクトルチャンネルからの酸素プローブ強度データを含むvsiファイルをマージモードで開きます。メジャーメニューから比分析機能ウィンドウを開きます。
参照チャンネルの強度を分子として選択し、感度チャンネルの強度をR計算の分母として選択します。比解析ウィンドウで、対応する強度しきい値設定を各スペクトルチャンネルに適用して、マージされた強度画像から背景を減算します。回転楕円体画像に適用されるROIマスクは、回転楕円体の境界を決定する。
画像の背景が均一に黒くなるまでしきい値を増やします。比率分析ウィンドウで、プレビュー画像が R グラデーションの望ましい解像度を提供するまで、比率画像に対するスケーリング係数を調整します。強度比分布の画像は、元のマルチチャンネル画像にレイヤーとして追加されます。
マルチチャンネル画像のウィンドウで、偽カラーバーでレイヤーをアクティブにします。比率分布ヒストグラムのリンク制限とリンク解除限界は、表示調整ウィンドウの固定スケーリングオプションを使用して手動で決定します。スフェロイドの対応する透過光画像を開きます。
線形定規関数を選択し、回転楕円体の直径を測定します。データをスプレッドシートのテーブルファイルとしてエクスポートします。必要なサイズと形状のROIを選択し、回転楕円体の周囲および低酸素コアに適用します。
ROIを測定対象に変換して、選択したROI内の平均Rを分析します。スプレッドシートと互換性のある表形式でデータをエクスポートします。回転楕円体の各顕微鏡セクションに測定値を適用して、回転楕円体直径RCおよびRPのデータセットを取得し、さらなる計算および統計的比較を実行します。
すべてのデータを 1 つのスプレッドシート ファイルに結合します。MMIR1プローブは、フォトブリーチングが低く、異なるミトコンドリア刺激に対するhDPSCスフェロイドにおける迅速な呼吸応答のリアルタイム研究に適している。FCCPは、いくつかの領域において軽度の脱共役効果のみを示し、その後、細胞呼吸をわずかに減少させた。
一方、ロテノンは呼吸を強く阻害し、刺激後約80秒以内に回転楕円体再酸素化および周辺からコアへの酸素勾配の散逸をもたらした。イメージングソフトウェアが提供するピクセル単位の強度比計算の自動プロトコルを使用して、すべての回転楕円体タイプでリアルタイムで検出された周辺からコアへの酸素勾配が、酸素化された周辺と低酸素ニッチを中心に視覚化されます。本明細書のグラフは、異なるスフェロイドタイプに対する赤道スフェロイド断面の比プロファイルを描写する。
ホモセルhDPSCスフェロイドと比較して、ヘテロセルhDPSCからHUVECスフェロイドへは有意に急勾配を有していた。ヘテロセルラースフェロイドにおける末梢からコアへの酸素勾配は、強い呼吸活性を有するhDPSCスフェロイド酸素化によるそれらの組成物中のhDPSCによって生成される可能性が高い。グラフは、バイオプリントされたhDPSCスフェロイドがバイオプリント前に測定されたスフェロイドよりも有意に酸素化された周辺部を有し、それらのコア酸素化が同様の値を有していたことを示している。
時折プローブが沈殿して均一なスフェロイド形成が妨げられる場合は、使用前にプローブ溶液を高速でろ過または遠心分離してください。針長測定および圧力調節の補正は、バイオプリント速度および支柱径およびバイオプリント微細凝集体を多孔質足場に一致させるために不可欠なステップである。酸素に敏感なプローブイメージング用の顕微鏡設定を選択し、プローブの光安定性への影響を考慮してください。
酸素イメージングは、多くのタイプのライブ顕微鏡測定と互換性があります。イメージング後、免疫蛍光、ウェスタンブロッティング用のタンパク質の抽出、または遺伝子発現解析を行うこともできます。
