提示されたプロトコルは、動物組織中の広範囲の脂質を定量することを可能にする。これは、脂質メカニズムを研究し、動物モデルにおける初期毒性を示すバイオマーカーを特定するための簡単なツールです。この方法は、サンプルあたり10分のトレンド時間で、さまざまなサンプルマトリックスで14の異なる脂質クラスで400を超える分子脂質の定量プロファイルを提供します。
まず、遠心分離機アリコート1上清を重炭酸アンモニウム緩衝液で濃度の2倍に希釈します。ウシ血清アルブミン検量線を調製した後、標準チューブをボルテックスし、チューブを18、200gで室温で15秒間遠心分離する。前に準備した標準チューブから、ブランク、標準、サンプルをそれぞれ6マイクロリットルを96ウェル平底プレートに移します。
次に、マルチチャンネルピペットを使用して250マイクロリットルのブラッドフォード試薬を各ウェルに加え、混合します。5分間インキュベートした後、プレートリーダーを用いて波長595ナノメートルの吸光度を測定する。総ブランクと内部標準ブランクの各チューブに100マイクロリットルの重炭酸アンモニウム溶液を入れた2ミリリットルのチューブを準備し、すべてのサンプルを氷上に保ちます。
10サンプルの各セットの間に1つの品質管理サンプルが配置されていることを考慮して、品質管理サンプルを準備します。10マイクロリットルのプールヒト血漿を2ミリリットルのチューブに加え、10マイクロリットルの内部標準溶液をすべての内部標準ブランク、品質管理、および研究サンプルにスパイクします。各サンプルに摂氏マイナス20度のブタノールメタノール混合物300マイクロリットルを加え、サーモミキサーで室温で10分間450 gで振とうします。
次に、300マイクロリットルのヘプタン酢酸エチル混合物を加え、サーモミキサー上で室温で10分間450gで振とうし、次に300マイクロリットルの1%禁欲酸混合物を加え、サーモミキサー上で室温で450gで5分間振とうする。室温で5分間2, 800gで遠心分離し、360マイクロリットルの上相を2とラベル付けされた新しい2ミリリットルのセルフロックチューブに移す。320マイクロリットルのヘプタン酢酸エチルを1とラベル付けした水相管に加えた後、サーモミキサー上で室温で450gで5分間振とうし、次に2,800gで室温で5分間遠心分離する。
320マイクロリットルの上相を移し、それらをチューブ2の前のステップからの画分と混ぜ合わせる。同様に、チューブ1の水相に250マイクロリットルのヘプタン酢酸エチルを加え、サーモミキサーで室温で450gで5分間振とうします。再び、室温で5分間2, 800gで遠心分離し、次いで200マイクロリットルの上相を移し、それをチューブ2中の前のステップからの画分と混合する。
真空濃縮器で摂氏35度で蒸発乾固し、300マイクロリットルのMS混合溶液に再溶解します。各チューブを5秒間ボルテックスしてすべてが溶解し、摂氏4度で5分間18, 200 gで遠心分離します。正イオン化モード分析のために50マイクロリットルのアリコートをマイクロリットルプレートに移し、50マイクロリットルのMSミックス溶液で希釈します。
再度、80マイクロリットルのMSミックスで希釈し、20マイクロリットルのアリコートをMTPプレートに移して負イオン化モード分析を行います。プレートをホイルで包み、分析前に摂氏4度に保ちます。分析の5日以内に、製造元の指示に従って、ポジティブモードとネガティブモードの両方でMSを校正します。
直接注入ナノソースを前もって取り付け、MSの移送キャピラリーと4.1マイクロメートルのノズルチップに対してチップホルダーに適切に位置合わせされていることを確認してから、ガス圧1.25psi、ソース電圧1.1キロボルト、5マイクロリットルのサンプル注入量に対応する正負の注入のパラメータを確認します。 接点閉鎖Rel1を2.5秒間、5分の納期、4°Cでプレート冷却してから、温度コントローラーをセットアップして新しいプレートを作成します。ポジティブモードの場合は、MSメソッドが毛細管温度250°C、SレンズRFレベル65.0に設定されていることをソフトウェアで確認および調整します。Xcalibur ソフトウェアで、ポジティブメソッドを開き、フルスキャン MS 取得が 100 万の自動ゲイン制御と 50 ミリ秒の最大射出時間で 140 , 000 の分解能で 550 〜 1 、 000 m/z の範囲で 0 分から 1 分に設定されていることを確認します。
ロック質量680.48022を適用します。データに依存しないMS/MS取得方法が、17, 500の分解能で1〜5分の時間範囲で、最初の質量が250 m/zに固定されていることを確認します。MS2の自動ゲイン制御が100, 000に設定され、最大射出時間が64ミリ秒、衝突エネルギーが20 NCE、絶縁ウィンドウが1 m/zに設定され、398から1, 100 m/zの介在質量リストが1ダルトンの質量ステップで使用されていることを確認してください。
ネガティブモードでのアクイジションでは、MSチューンファイルのSレンズRFレベル65.0でキャピラリー温度が摂氏250度に設定されていることをチューニングソフトウェアに確認してください。次に、Xcaliburソフトウェアで、フルスキャン取得モードが400〜940 m / zの範囲をカバーする140, 000の解像度で0〜1分に設定され、100万の自動ゲイン制御、200ミリ秒の最大射出時間、および526.46262のロック質量。DIAモードでのMS2取得が、1ダルトンの質量ステップで400〜940の介在質量リストを使用して、17, 500の分解能で17, 500、固定された最初の質量、100、000、64ミリ秒の最大射出時間、35 NCEの自動ゲイン制御で実行の1〜5分に設定されていることを確認してください。
Xcaliburソフトウェアでポジティブモードで分析シーケンスキューを作成してトリガーし、ChipSoftソフトウェアでシーケンスを作成し、各サンプルの直接注入ロボットからのコンタクトクロージャ信号によってサンプル取得がトリガーされるのを待って分析を開始します。ポジティブモード分析が完了したら、Xcaliburソフトウェアでネガティブモードで分析シーケンスキューを作成してトリガーし、ChipSoftソフトウェアでシーケンスを作成し、各サンプルの直接注入ロボットからのコンタクトクロージャ信号によってサンプル取得がトリガーされるのを待って分析を開始します。正規化された総脂質濃度は、PE、PEO、PC、PCO、PI、およびPG脂質クラスでわずかに上昇し、SM、LPE、およびPA脂質でいくつかのダウンレギュレーションが観察された14の最も豊富な脂質クラスから同定および定量化されました。
TAGとPSでは違いは見られませんでしたが。これらの結果はまた、全分子式に基づく分子特徴のうち、100〜120の化合物がタバコの煙曝露によって有意に影響されたことを示しています。MS2フラグメンテーションのデコンボリューションとフラグメントシグナル強度の正規化により、各脂質ガラスで表される各共役脂肪酸の総量のおおよその定義と、曝露群と対照群の間のこれらのデータの比較が可能になりました。完全飽和脂肪酸と少数の不飽和脂肪酸の減少が観察されたが、PC、PE、およびPGリン脂質クラスの組成中の多価不飽和脂肪酸は、すべての時点でタバコの煙群で上昇した。
エイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸を結合させたPCおよびPGの極端な症例は、3R4F CS曝露群でのみ検出されました。サンプルとQCサンプルのピペッティングは、ローバンドチップで正確である必要があり、各サンプル間でチップをチェックする必要があります。内部標準液のピペッティングは非常に重要であり、正確でなければなりません。
1対1のジクロロメタンメタノールの溶液は注意して取り扱う必要があり、サンプルにプラスチックポリマーが含まれないように、チップを含む非可塑剤を使用する必要があります。ヒントは各サンプル間で変更する必要があります。
