この縦書きは、機能的な膜貫通型受容体を持つ細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラムを組み立てる際の重要なステップを示しています。これらのカラムは、複雑な抽出物中に存在し、固定化された膜貫通型受容体と相互作用する小分子の同定に使用できます。細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラムは、複雑な混合物中に存在する生物学的に活性な化合物の同定を高速化します。
細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラムの使用は、植物、真菌、または細菌抽出物などの複雑な天然マトリックス中に存在する薬理学的に活性な化合物の同定に関心のある人にとって特に興味深いものとなり得る。開始するには、120ミリリットルのベンズアミジンを5ミリリットルの超高純度脱イオン水に溶解して200ミリモルのベンズアミジンストック溶液を調製する。ヒュームフード内の10ミリリットルのエタノールに0.017グラムのPMSFを溶解することによって、10ミリモルのPMSFストック溶液を調製する。
市販のプロテアーゼ阻害剤混合物を1ミリリットルの超純イオン交換水に溶解して100Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを調製する。よく混ぜ合わせ、200〜300マイクロリットルのカクテルをアリコートします。1ミリリットルのイオン化超純水に55.114ミリグラムのATP二ナトリウム塩水和物を溶解して100ミリモルのATP原液を調製する。
十分に混合し、混合物の100マイクロリットルをアリコートする。3.03グラムのトリス-HCL、2.9グラムの塩化ナトリウム、0.22グラムの塩化カルシウム無水、0.2グラムの塩化マグネシウム六水和物、および0.19グラムの塩化カリウムを500ミリリットルの超高純度脱イオン水に溶解して緩衝液を調製する。17.3ミリリットルのトリス緩衝液を0.3ミリリットルのベンズアミジン原液、0.2ミリリットルのPMSFストック溶液、0.2ミリリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテル、20マイクロリットルのATPストック溶液、2ミリリットルのグリセロール、および0.029グラムのEDTAと混合することによってホモジナイズ緩衝液を調製する。
塩酸溶液を用いてpHを7.4に調整する。4°Cで回収した細胞を400 x gで5分間スピンダウンし、上清を除去し、残りの細胞ペレットを10ミリリットルの1X pH 7.4氷冷PBSで洗浄する。上清を捨て、20ミリリットルのホモジナイズバッファーを加える。
円錐形のチューブを氷の上に置きます。細胞懸濁液を40ミリリットルのDounceホモジナイザー組織グラインダーに移し、40回の上下の乳棒ストロークを使用して氷上で懸濁液を手動で均質化する。ホモジナイズした細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移し、ペレットを捨て、上清を新しい円錐管に移す。
細胞膜ペレットを保存し、上清を捨てる。8.7ミリリットルの緩衝液を0.1ミリリットルのPMSFストック溶液、0.15ミリリットルのベンズアミジンストック溶液、0.1ミリリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテル、10マイクロリットルのATPストック溶液、1ミリリットルのグリセロール、および0.2グラムのコール酸ナトリウムと混合することによって可溶化緩衝液を調製する。可溶化緩衝液を細胞膜断片と共に円錐管に移す。
ペレットを再懸濁する。得られた混合物を摂氏4度で150RPMで18時間回転させる。18時間後、可溶化混合物を摂氏4度で47、900 x gで30分間遠心分離する。
100 ミリグラムの IAM を追加します。パソコン。DD2粒子を上清にし、得られた懸濁液混合物を摂氏4度で150RPMで1時間回転させた。24グラムのトリス塩酸、23.4グラムの塩化ナトリウム、0.06グラムの塩化カルシウム、5.85グラムのEDTA、および0.07グラムのPMSFを加えて、4リットルの超高純度脱イオン水に透析バッファーを調製する。
PMSFをまず少量のエタノールに溶解し、次いで緩衝液と共にビーカーにゆっくりと加える。透析チューブのセルロース膜を10センチカットして透析チューブを作製し、IAMを含む懸濁液を移した。パソコン。DD2粒子および細胞膜断片を透析チューブに入れる。
透析チューブの両端を透析チューブクリップで閉じます。透析チューブを透析バッファーに入れます。24時間後、新しく調製した透析バッファーに透析チューブを入れ、さらに24時間透析を続けた。
IAMを洗浄するために使用される10ミリモルのpH 7.4酢酸アンモニウム緩衝液を調製する。パソコン。DD2粒子およびカラム内特性評価実験は、0.778グラムの酢酸アンモニウムを1リットルの超高純度脱イオン水に溶解した。透析の48時間後、透析緩衝液から透析チューブを取り出し、透析チューブの内容物を15ミリリットルの円錐形チューブに移す。
上清を捨て、残りのペレットを10ミリリットルの酢酸アンモニウム緩衝液で3回洗浄する。3回目の洗浄後、残りのペレットを1ミリリットルの酢酸アンモニウム緩衝液に再懸濁する。それを十分に混合し、得られたスラリーを使用して5 x 20ガラスカラムを充填し、CMACクロマトグラフィーカラムを得た。
カラムを充填するには、酢酸アンモニウムバッファーで浸した下部フィルターをフィルターホルダーに入れます。フィルターホルダーをガラスカラムに嵌め込み、カラムキャップをねじ込んでホルダーの位置を固定します。カラムをフィンガークランプに垂直に置き、ラボスタンドに固定します。
カラムの下にビーカーを置き、ピペットチップをガラスカラム壁に保持するシングルチャンネルピペッターで少量のスラリーをガラスカラムにゆっくりと移します。パッキングプロセスをスピードアップするには、各ステップの間にマイクロピペットで固定ベッドの上からバッファーを除去します。上部フィルターを配置し、固定相の上にバッファーが残らないようにアダプター・ユニットをねじ込みます。
アダプター・ロックでアダプター装置の位置を固定します。カラムを高速液体クロマトグラフィーポンプに接続し、酢酸アンモニウム緩衝液でカラムを一晩洗浄し、流速を毎分0.2ミリリットルに設定した。長期間保存するには、酢酸アンモニウムバッファー中の0.05%アジ化ナトリウム溶液でカラムを稼働させ、アジ化ナトリウムを使用するときはラボコート、安全メガネ、手袋を着用し、摂氏 4 度で保管してください。
パソコン。DD2粒子は、固定化された神経芽細胞腫TrkB細胞膜断片と共に、BDNFの存在下で、蛍光粒子を生じた。TrkBヌル細胞膜内包IAM粒子において蛍光は観察されなかったか、またはTrkB細胞膜内包IAM粒子のようにBDNFが用いられなかった場合。機能的CMACカラムに固定化されたTrkB受容体に対する1ミリモル、750ナノモル、500ナノモル、および300ナノモルのDHF濃度の増加の典型的な正面親和性クロマトグラムが示され、これは保持時間の濃度依存的な変化を示した。
非機能的なCMACカラムは、マーカーリガンドの保持における濃度依存性変化の欠如を示した。CMACネガティブコントロールカラムは、非特異的相互作用を排除するために標的タンパク質を発現させない細胞膜断片を固定化することによって調製した。0.2%水性ゴツコラ抽出物の添加は、7,8−DHF保持の有意な減少をもたらし、アゴニスト結合部位に対する競合するリガンドの存在を示す。
CMAC陰性TrkBヌルカラム上の7,8-DHF保持の減少の欠如は、このカラム上の機能的なTrkB受容体の欠如をさらに確認した。欠落ピーククロマトグラフィーアプローチは、TrkBヌルカラムで早期に溶出しながら、TrkBカラムに強く保持された化合物を同定し、特異的相互作用を示す。高速細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラムの受容体源を知ることは非常に重要です。
均質化および可溶化バッファーを適切に設計するために、必ず文献を確認してください。このプロトコールで調製した細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラムは、新規の潜在的な薬物ヒットを同定し、固定化受容体とその天然リガンドとの間の相互作用の性質を特徴付けるために使用された。
