我々はFOXP1に対する抗体の種類のギフトのための多くの洞察に満ちた議論とB Novitchためシャロン自慢に感謝したいと思います。 KCTするウェルカムトラストから学生の身分とウェルカムトラストからSRP（グラント参照番号094399/B/10/Z）へのプロジェクトの助成金を受けて、この作品。

1。必要な溶液を作る<ol><li> 1 Mリン酸緩衝液：109.4グラムのNa 2 HPO 4、32グラムのNaH 2 PO 4を秤量、H 2 0、1リットルの全量を水に混ぜて溶かす。 </li><li> リン酸緩衝生理食塩水（PBS）：0.1 Mリン酸緩衝液、0.15M NaClを準備します。 PBSを100ミリリットル、10胚からスライスの処理のために十分であるべきです。 </li><li> アガロース：約70〜ヒートPBS溶液℃、固体低融点アガロースを加え、ゆっくり連続的に攪拌しながら。 4％（w / v）アガロースの最終濃度に溶液を作る。この溶液50mlの在庫を確認します。必要になるまで48℃に保た℃の水浴にこのソリューションを残す。実験後、未使用の任意のアガロース溶液は数週間のために4℃で保存することができます。 </li><li> 抗体·ブロック·ソリューション：最終concentrにウシ胎児血清およびTriton X-100を追加1％のation（v / v）ウシ胎児血清、0.1％（v / v）トリトンX-100、PBSインチブロック溶液10ml凍結切片のスライド5枚の免疫染色のために十分であろう。 </li><li> 固定液：0.75ミリメートルのNaOH、4％（w / v）パラホルムアルデヒド（注意）を準備します。 70への水の熱固定に必要な量を準備するには℃、溶解するまで固体パラホルムアルデヒドとミックスを追加し、必要な最終濃度に濃NaOHを加える。 4℃に氷冷しこの溶液10ml胚スライスの20ウェルのために十分であろう。 </li><li> ショ糖液：0.1 Mリン酸緩衝液を含む30％（w / v）スクロース溶液10mlを準備します。この溶液10ml胚スライスの10ウェルのために十分であろう。 </li><li> 70％（v / v）エタノールは、水30mlと無水エタノール70mlを希釈します。 </li><li> 培養液：1％ニワトリ胚エキス、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、0.35％のL-グルタミン、0.1％2 - mercaptoethの溶液を調製anol、4％ニワトリ血清、2％B27サプリメント、100 ng / mlのciliaryneurotrophic成長因子（CNTF）は、すべてのNeurobasal培地で希釈し、氷上で調製し、同じ日に使用。培地10mlを胚スライスの20ウェルのために必要です。 </li></ol> 2。ニワトリ胚の準備<ol><li>彼らは15 24を上演するために開発するまで、場所は38で強制通風イン ​​キュベーター内で水平方向に長い辺°Cの鶏の卵を受精。これは通常のインキュベーションは、約4日を要します。 </li><li>インキュベーションの二日目に、70％エタノールに浸したティッシュペーパーで拭いて卵の殻を殺菌。慎重にピアス5 mlシリンジに取り付けられており、アルブミンの5ミリリットルを取り除く21ゲージの針を用いて卵の殻の平らな端。シェルを開いたときに胚が損傷していないので、これが離れてシェルから胚を下げる。インキュベーターに卵を返し、さらに2日間のためにそれらをインキュベートする。 </li><li>鈍いデュモン＃5鉗子cを用いてarefullyピアスシェルの上部中央とシェルの9 cm 2の周りに取り外します。胚の周りにカットし、慎重に解剖中にHBSS中に胚と場所を持ち上げて外します。胚はハンバーガーとハミルトン（1992）15によると上演されるべきである。使用した全ての胚はステージ24に​​近い速度でなければなりません。異常の兆候を示し、任意の胚は破棄されるべきである。 </li><li>羊膜、絨毛膜尿膜、ヘッド、2デュモン＃5鉗子を用いて尿膜を取り除きます。すべての内臓を除去するために胚を骨抜きにする。これを行うには、ミクロ解剖ハサミで胚の腹側正中を切開する鉗子の1ペアで吻側トランク領域の周囲に胚を保持、腸、心臓の吻側部分をつかむと尾側に引っ張る。それは、これがきれいに行われることが重要である。あなたは、胚は体節はっきり見ることができるはずです。横方向胸部ボディをトリムアッパーと下肢buds.Now間、半分に胚をカット顕微解剖ハサミを使用して壁。 </li></ol> 3。胚スライス標本<ol><li>水浴からアガロース溶液を除去します。使い捨ての3ミリリットルプラスチックパスツールピペットの底から5cmを切った。 </li><li>乾いたシャーレ内解剖ソリューションと場所のクレードル胚を実施するために2つの鉗子を用いて解剖した胚の腰椎半分を削除します。パスツールピペットを用いて、胚の上、アガロースの2ミリリットルの周りにピペット約0.5mlを削除してからピペットに胚のスライスを吸う。プラスチック金型は、アガロースで任意の気泡を導入しないように世話をはがすに胚およびアガロースを転送します。そっと下向き胸部セクションが付いているプラ​​スチック金型でアガロースの底に胚を下げる。胚はストレート21ゲージ針を使用しているように配置されるべきである。スライスはまた、発展途上四肢の一部が含まれますし、それが重要である寒天での胚の向き大証はこれを許可します。アガロースを設定するには、氷の上にボートを配置します。胚が（2分前後）、この期間中に向きを変更しないよう注意してください。 </li><li>ライカVT1000Sビブラトーム（スピード3、周波数4、厚さ400μmのスライスが）スライス室HBSSで充填され、氷のように冷たい水に囲まれたを使用して設定されるべきである。アガロースブ​​ロックは、スーパー接着剤でビブラトームプラットフォームに貼り付いている。アガロースブ​​ロックは、それを取り巻くアガロース1-3のmmの胚の部分を残すようにカミソリの刃でトリミングされています。明確な外胚葉性頂rigdeと肢芽のセクションを含むスライスが選択され、これらのスライスは、その後、HBSS中に配置されます。一般的に、胚あたりわずか1〜2つの適当なスライスがあります。穏やかに2本の針を用いて組織切片の周囲にアガロースを削除します。それは、これが徹底的かつ慎重に行われていることが不可欠です。 </li></ol> 4。培養胚スライス<ol><li> requirに培養液500mlを（上述）を追加24ウェル超低付着扱わ組織培養プレートのウェルのED番号。ウェルにHBSS溶液から慎重にスライスを転送します。一般的に、我々は各ウェルで二から三スライスを用意してみてください。 24時間、5％CO 2で37℃で組織培養インキュベーター中で24ウェルプレートを置きます。 </li></ol> 5。免疫染色のスライスをセクショニング<ol><li>培養期間の後、胚スライスの各ウェルにバッファリングされていない修正の500μlを添加し、氷上で20分間のままにしておきます。トータルソリューションを慎重に除去し、PBSで3回洗浄を5分間隔で行われています。スライスはその後6時間のまわりに、スライス·シンクまで、4℃でのショ糖溶液に残されていますが（ 例えば一晩）長く放置することができます。 </li><li> 20℃で余分なスクロース溶液オフスライスとDABを削除して、約5分間の周りに1ミリリットル10月に平衡はぐ10月に満ちたプラスチック金型の各スライスフラットをマウントします。マウントした後、固化させる垂直にドライアイス上に金を置く。 </li><li>クライオスタットに10月のブロックをマウントし、約20分間-24℃でブロックを平衡化します。 Superfrostプラススラ​​イド上にマウント15ミリメートルのセクションで、それぞれのスライスを切った。それらが必要になるまでスライドは-80℃で保存することができます。 </li></ol> 6。免疫蛍光<ol><li>室（我々はオートクレーブテープで固定し、1または2 mlプラスチックピペットを使用）の底から隆起したスライドを使って加湿チャンバーで開催された水平方向のスライド上のPBSピペット1〜2ミリリットル。 °過剰OCTはスライドからのPBS溶液を除去し、セクションの上にブロック溶液500mlを追加、削除するためのC、20℃で30分間インキュベートする20℃で5分間、PBS中のセクションをインキュベートブロック溶液を除去し、直ちに希釈した一次抗体の500ミリリットルを追加°Cで18から22時間、4℃でインキュベートし、スライドに追加しました。 </li><li>一次抗体溶液を除去して、すぐにあった時間20℃で5分間、3回1mlのPBSでスライド°Cの過剰な一次抗体溶液を除去した。セクションの上に希釈した二次抗体の500ミリリットルを追加します。次いで、スライドを30分間20℃で放置されています。二次抗体溶液を除去し、スライドは20℃でPBSで3回5分間洗浄し、 </li><li>これらの洗浄に続いて、最後のPBSで洗浄、DAB過剰のPBSを除去し、スライドの端を取り外し、スライド上vectashield 2滴を加え、穏やかに気泡形成を回避し、セクションの上にカバーガラスを築く。イメージを作成する前にスライドの端からブロッティングにより過剰Vectashieldを削除します。 </li></ol> 7。イメージング<ol><li>免疫染色画像のセクションを。我々はHamammatsu ORCA ERデジタルカメラ、10、X、20Xと40 Xの対物レンズを搭載したニコンのEclipse E80i蛍光顕微鏡を使用しています。 </li></ol>

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執筆者はいずれも、利益や利害の対立が競合していない。

ここで説明されたプロトコルは、ニワトリ胚スライスは運動ニューロンが生きて維持し、培養期間中に移行するために継続しながら、複数の日インキュベートすることができます。運動神経細胞が生き続けるための条件を解明することに、我々は必要ないくつかの重要な機能を同定した。これは最大4％のニワトリ血清は運動ニューロンと異なる種由来の血清との交換の生存に不可欠である容認されないと思われます。興味深いことに、我々は、彼らがスライス状の総歪みにつながる組織の増殖を促進し、血清の高い濃度の存在はスライスに有害であることがわかった。さらに重要なのは、cilliary神経栄養因子の存在も重要で証明した。それはおそらく、脊髄への感覚求心性入力の可視化を可能にする、スライスがちょうど24時間よりかなり長い期間にわたって培養することができるかもしれないという異なる可能性のままである。また、文化ここでの温度の条件も開発脳幹と中脳/小脳の文化をスライスするのに有用証明するかもしれない。 おそらく、これらのスライス培養条件の使用で最大の潜在的な利点は、彼らは、心臓など胚の他の部分への悪影響、の可能性を最小限に抑えながら、タンパク質機能の薬理学的操作の可能性を促進することである。異なるシグナル伝達経路の阻害剤およびア​​ゴニストは、多数の異なる脊髄ニューロンのサブタイプの移行と、潜在的に、開発時にローカル脊髄回路の形成に与える影響を評価するために使用することができます。さらに、このようなsiRNAおよびモルホリノオリゴヌクレオチドを利用するものとして、タンパク質発現のいくつかの遺伝的摂動が、彼 ​​らは唯一の開発の早い段階で導入される（OVOエレクトロポレーション·プロシージャ内の制限のせいで）とのエフェクトは最後のことができるという事実に苦しむティムの短い期間メール（通常1日）。私たちのスライス培養は後の段階で開始し、スライスの培養期間中にそれらの効果を表示するスライスの段階で開発の後半でこの技術を使用する可能性に優れています。 スライス培養プロトコルはまた、両方の脊髄運動ニューロンと同様にタイムラプスビデオ顕微鏡を介してリアルタイムで背側介在ニューロン移動の可視化される可能性があります。これは、白色光の下や蛍光イメージングを使用して、位相差顕微鏡を用いて達成することができる。後者の手法は、次に使用されることになっているなら蛍光標識の導入が必要とされている。これは、ニューロンのサブセットで蛍光タンパク質を駆動するために心室からまたは構文の卵エレクトロポレーションで四肢または順行性標識のいずれかから逆行性標識法を介してこのようなDiIまたはDIOなどの蛍光色素を導入することにより、どちらかを達成することができた。

正常な胚発生時には、多くの異なる細胞型は、その取得元から、彼らは最終的に成熟した生体で機能する場所に移行する必要がありますが生成されています。開発脊髄内では、前駆細胞が正中線での脳室帯に位置し、感覚処理とモータ出力1に必要な機能的な神経回路に統合されるように移行する必要が分裂終了ニューロンとグリア細胞の多くのサブタイプが生成されています。手足の筋肉の収縮を制御する脊髄運動ニューロンが広く研究されていると多くは、それらの異なるサブクラスの形成を駆動する分子やメカニズムが知られています。しかし、はるかに少ないが、運動ニューロンは、移行分離し、シナプス入力を受け取ることができるメカニズムが知られています。 運動ニューロンサブタイプのアイデンティティが階層的に開発中に取得されます。運動ニューロンのサブタイプは、大まかに分類することができます私はNTO個別の列、それらの軸索突起によって定義されている部門とプール。軸、内臓や手足の筋肉のいずれかにモーターが列プロジェクトの軸索を。モータの分割は腹や背の筋肉2に突出するものに横モーターカラム（LMC）の運動ニューロンを投影手足を細分化する。部署内では、運動ニューロンのクラスターは手足2、3の個々の筋肉にモータープールのプロジェクトと呼ばれる。部門別IDはホメオドメイン転写因子膵島-1（腹側に突出した）またはLHX-1（背側に突出した）6の発現によって特徴付けられる一方、肢突出した運動神経細胞は、転写因子FOXP1 4,5の発現によって定義されます。実際、LHX-1の発現は運動ニューロン7の適切な背の投影法で必要とされる。これらのサブタイプは、脊髄内の異なる位置を占める。腹側に突出する運動ニューロンは背projecti内側に存在するようになってきngの運動ニューロン。 LMCこの結果、いわゆるLMCmedial（LMCm）とLMClateral（LMCl）部門に分離されている。部門やモータープールの組織は、二期8で取得されています。最初のフェーズでは、部門分離は横ファッションに内側特性の運動ニューロンの遊走を介して達成される。 LMCl細胞は細胞LMCm後に生成されるので、LMClはその最終位置整を達成するためにLMCmを通って移動しています。第二フェーズでは、運動神経の背腹ソートを介して、おそらく、運動ニューロンプールに分割し、それらのクラスタ内の運動ニューロンを取ります。カテニン依存古典的カドヘリンファミリーのメンバーは、運動ニューロン組織8-10の両方のフェーズに不可欠であることが示されている。しかし、カドヘリン機能は細胞の動きを制御する方法を十分に理解されていない。 柱状、部門やプールIDの取得は、外因性の信号を必要とするそのパターンintrinsi転写因子11のCの式。さらに、すべての運動ニューロンの約50％は、主に運動ニューロンの生存の神経栄養サポートを通じて、四肢から外因性の信号を必要とするプロセスで通常の開発時にはアポトーシスを介して死ぬ。したがって、運動ニューロンの開発は比較的長い時間経過にわたって維持するために適切な環境を必要とします。このような理由から、運動ニューロンの生存を維持するために、脊髄スライス培養を生成の実用性は、適切な培養条件の解明が必要である。前の胚の切片培養は外因追加精製ニューロン集団の挙動12-14従うために使用されている。しかし、スライス自体の中にその場で運動ニューロンの生存および移行を容易にする、我々の知識の培養条件に発表されていない。我々は、精製の生存を促進する標準的な培養条件を変更し、解離頭蓋の運動ニューロンは、mを容易にする胚スライス培養系内のニューロンotor開発。また、生き残った運動ニューロンの位置を監視し、運動ニューロン部門の大部分は正常な位置は培養期間中に取得されていることを実証している。

<table border="1"><tbody><tr><td>卵</td><td>スチュアートヘンリ農場、英国</td><td></td><td> FertilisedブラウンBovanゴールド鶏卵（スチュアートヘンリファームズ、英国）、14℃で保存するまでインキュベーション</td></tr><tr><td> 21ゲージ針</td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> 5mlシリンジ</td><td> BDプラスチ</td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> ＃5デュモン鉗子</td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td>ミクロ解剖ハサミ</td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> （ストレートで3.5） </td></tr><tr><td>胚の埋め込み型：剥がれカビ</td><td>科学寒天</td><td> G3764 </td><td>ピラミッド型22ミリメートルに12ミリメートル</td></tr><tr><td>スーパー接着剤</td><td></td><td></td><td>パワーフレックス、ロックタイト</td></tr><tr><td>エタノール</td><td> SIGMA </td><td> 32221 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td>ナトリウム二水素リン酸塩、一水和物</td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td>ジナトリウムモノリン酸水素</td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>インビトロジェン</td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>ギブコ</td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td> FLUKA </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製の使い捨てパスツールピペット</td><td> ElKay精密実験室消耗品</td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3ミリリットルの容積</td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液（HBSS） </td><td>ギブコ</td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td>ニワトリ胚エキス</td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>ギブコ</td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン溶液</td><td>ギブコ</td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td>ギブコ</td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td>ウマ血清</td><td>南部グループラボ</td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17504-044 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> Neurobasal培地</td><td>ギブコ</td><td>猫〜2103 </td><td></td></tr><tr><td> CilliaryNeurotrophic因子（CNTF） </td><td> RとDシステムズ</td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td>ニワトリ血清</td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td>一次抗体</td><td></td><td></td><td>カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）のベネットNovitchから親切な贈り物だった抗FOXP1抗体を除き、発達研究ハイブリドーマ銀行から購入した。一次抗体の希釈は、ウサギ抗FOXP1（1/32000）、マウス抗Lhx1 / 2（4F2）（1/50）、モルモット抗FOXP1（1/1000）であった。 全ての抗体は4℃で保存した。 </td></tr><tr><td>二次抗体</td><td></td><td></td><td>ジャクソンImmunoreseachラボラトリーズロバ抗マウス（のAlexa Fluor 488）（1:1000）、ウイスキーから購入したロバ抗モルモット（Cy3に）（1:1000）EY抗ウサギ（Alexa Fluor 594の）（1:1000）は、Invitrogenから購入 全ての抗体は4℃で保存した。 </td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>コー​​ニングCOSTAR </td><td> 3473 </td><td>超アタッチメント24ウェルプレート</td></tr><tr><td> 10月</td><td>組織テック、さくら</td><td> 4583 </td><td>最適切断温度</td></tr><tr><td> Vectashield </td><td>ベクトルラボ</td><td> H1000 </td><td> Vectashield蛍光マウンティング培地</td></tr><tr><td>スライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td> Superfrost-Plusは正に帯電し、スライド、25×75×1.0ミリメートル</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 631-0167 </td><td> 25x60ミリメートル</td></tr><tr><td>ドラフトインキュベーターを余儀なく： </td><td>リヨン·エレクトリック·カンパニー</td><td></td><td> 38℃に維持し、常に十分な水位を確保することによって多湿に保た</td></tr><tr><td>低温保持装置</td><td>ブライト、ハンティンドン、イギリス</td><td></td><td> -36℃〜 </td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター</td><td> DHオートフロー</td><td></td><td> Nuaire 38℃、5％CO 2で</td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td></td><td>ライカVT1000-S </td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>ニコンエクリプスE80i蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>ニコン</td><td></td><td>ニコンDS5MとHamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

chicken embryo spinal cord slice culture protocol

スライス培養は、両方の薬理学的および遺伝子操作により胚の操作を容易にすることができます。この減少したシステムでは、全身薬物アプリケーションに起因する潜在的な致死的な副作用を克服することができます。しかしながら、培養条件は、スライスの低減環境内で、通常の開発が進むことを確認する必要があります。我々は、特に脊髄運動ニューロンのことを、脊髄の開発に焦点を当てている。私たちは、体系的にほとんどの脊髄運動ニューロンが生まれてきた時点からニワトリ胚スライスの培養条件を変化させた。我々は、in vivoでのそれに比べ培養期間とそれらの運動ニューロンの位置の間に生き残った運動ニューロンの数と種類を測定した。我々は、血清型および神経栄養因子は培養期間中に必要とし、少なくとも24時間の運動ニューロンが生き続けると、それらの運動ニューロンで適切なポジションに移行できるようにすることができましたが見つかりました脊髄。我々は、これらの培養条件およびアガロースに埋め込ま骨抜きニワトリ胚を用いた胚切片培養物を調製する方法論を提示し、ビブラトームを用いてスライス。

介在ニューロンと投射ニューロンの発達に従わ培養スライスを使用すると、皮質16内の組織の世代の我々の理解が進んで影響を与えてきた。脊髄では、運動神経の発達が全体ゼブラフィッシュ胚の培養液17を使用して続いてきた。しかし、ゼブラフィッシュにおける脊髄運動ニューロンの組織は（魚の大きな四肢筋の不足のために）比較的単純である。高等脊椎動物の開発中に脊髄の運動ニューロンの組織の階層を駆動する分子メカニズムは現在のところほとんどわかっていない。高等脊椎動物の胚切片培養におけるニューロンの生存と細胞体の移行を促進する培養条件は、このように必要とされる。現在、高等脊椎動物の脊髄スライス培養をスライス12月14日の上にシード解離ニューロンに使用されてきたが、スライスの周囲に蛍光標識軸索を調べる18、または早期脊髄開発19の前駆細胞の振る舞いの。特に後脊髄運動ニューロンの発展を維持するそれらのためのスライス培養条件は、現在不足している。 特に脊髄運動ニューロンのことを、脊髄神経発達をフォローしようとするために、我々は、ニューロンの側方移動を介してモータの組織内の運動ニューロンの生存と初回注文の獲得を促進する可能性のある様々な培養条件を検討した。 20ニワトリ胚脊髄スライスを上演するステージ18を用いた初期の試験では無益証明し、我々は数時間以上の運動ニューロンが生き続けることができませんでしたし、培養期間（データ上LMCl細胞のかなりの数の世代を実証することができませんでした示されていない）。したがって、私たちはステージのスライス培養24胚LMClとLMCmニューロンの大部分が生成された時点を調査したが、LMClニューロン移行はそのiのままであるときnfancy（ 図1a-c）です。 LMClニューロンのこの横方向の移行は後24から36時間（ 図1 DF）の周りに、ステージ27でほぼ完了です。我々のアッセイは、このように神経細胞が生き続けることと腹角に横方向の移行を容易にすることができるというように単純化することができます。我々はニワトリ血清またはニワトリ胚抽出物の有無にかかわらず、ちょうどハンクス平衡塩溶液を含む比較的単純な培養条件で我々の実験を開始しました。我々はスライス内のLMCニューロンを維持することができましたが、すべてのケースにおいて、我々は維持されてLMClニューロンの少し証拠を発見した（少なくともLHX-1の発現によって）。さらに、我々はそのような背側脊髄でHB9などの遺伝子の不適切な発現は、in vivo（データは示していない） には発生することのないような状況を発見した。したがって、これらの単純な培養条件は、運動ニューロン組織の買収の調査には適していません。 そこで我々は、より複雑なconditioを捜し出しnsと解離胚鶏脳神経運動ニューロンの生存を促進するために公開されている製剤に使用されるベースとして。この条件は20（1％ニワトリ胚エキス、1％ペンのStrep、0.35％L-グルタミン、0.1％2 -メルカプトエタノール、2％ウマ血清、2％B27サプリメントとNeurobasal培地で50 ng / mlのciliaryneurotrophic成長因子（CNTF） （ここではガスリー培地と呼ばれる）は、よりシンプルなメディアよりも生きている多くの運動ニューロンを保つた。さらに、それは背側脊髄における転写因子のスプリアスの発現には至らなかった。しかし、LMClニューロンの生存率は（ 図1 GI、不良であったp）は、我々は、したがって、我々はガスリー培地、血清の起源すなわち動物、血清中の濃度が、培地中CNTFの濃度の重要な要因であると考えたものに変化した。我々が発見したウマ血清から血清を変えるチック血清および実質トン増加した50 ng / mlから100 ng / mLにCNTFの濃度の増加に彼LMClとLMCm細胞の生存とも培養条件の24時間（ 図1 JL、p）上腹角への移行を可能にした。運動ニューロン、LMClとにLMCmの比率の合計数は、確かに、前角にLMCl細胞の移動（ 図 OVOではなくスライス培養における開発を許可されていた胚のセクションと非常によく似て登場1 KO、p）である。したがって、私たちはその運動ニューロンの転写因子の発現、細胞数と位置に基づいて、我々のスライス培養条件は、少なくとも24時間かけて通常の脊髄運動ニューロンの発達を繰り返すと信じています。 <img alt="図1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> 図1。 - C。 LMCの世代の状態（内FOXP1染色b）とLMCl（LHX-1ステージ24時）で染色。 cは2チャンネルのマージです。正中線は、Dの点線で示されているVは、脊髄の背腹（D、V）軸の向きを示しているD - F。 。LMC（dのFOXP1染色）とLMCl（eのLHX-1染色）ステージ27で組織の状態、fは 2チャンネルのマージであるG - I。 LHX-1（g）とFOXP1（h）の頭蓋運動ニューロン細胞の生存をサポートする培地で培養し、スライスのセクション内での発現（ガスリー媒体であって、私たちの&quot;初期メディアが、&quot;基準20を参照）。 FOXP1表現によって証明LMCの細胞のいくつかの生存はあるもののLHX-1はもはや、運動ニューロンに発現していません。 （g）のD、Vは、脊髄の背腹（D、V）軸の方向を示しています。 MLはsの中外（M、L）軸の向きを示していpinalコードJ - L。 LMCl細胞（jの前角でLHX-1）と一般的にLMCは、（kにおけるFOXP1）4％ニワトリ血清および100 ng / mlのCNTFを含む培地で培養スライスで観察することができます。一部LMCl細胞は脊髄前角における横方向の位置で発見されることに注意してください。の矢印（j）は LMCl細胞のいくつかの横方向の位置を示しています。 （l）は 2チャンネルのマージである m - O。 L - LHX-1（M）と jに示す胚のスライス培養中に卵内に保持胚のセクションでFOXP1（n）の発現状況。 （O）2チャンネルのマージです。pは 。 LMClの割合（FOXP1 + VE / Lhx1 + VE）異なる条件cのスライス培養で見つかった細胞対LMC（FOXP1 + VE / Lhx1-VE）細胞の定量OVO（100％を表す） に保持された胚を制御するompared。スチューデントt-検定***はP &lt;0.01を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。

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Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

スライス培養、遺伝子的および薬理学的摂動による胚の操作を容易にする。しかしながら、培養条件は、通常の開発では、スライスの低減環境内で進めることができることを確認する必要があります。我々は、少なくとも24時間にわたって進行する通常の脊髄の開発が容易にプロトコルを示している。

ニワトリ胚脊髄スライス培養プロトコル

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

chicken-embryo-spinal-cord-slice-culture-protocol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.9K ビュー.  University College London. スライス培養、遺伝子的および薬理学的摂動による胚の操作を容易にする。しかしながら、培養条件は、通常の開発では、スライスの低減環境内で進めることができることを確認する必要があります。我々は、少なくとも24時間にわたって進行する通常の脊髄の開発が容易にプロトコルを示している。

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

培養皿内の機能モーターユニット：脊髄外植片と筋細胞の共培養

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル<em&gt;その場で</em&gt;幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

アン<em&gt;エクスビボ</em&gt;レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

リズミカルにアクティブな準備体外新生児齧歯動物脳幹-脊髄損傷で薄くスライス

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique eliminates laminectomy by removing two spinous processes and lifting, then tilting the caudal vertebral arch. The surgical area opens up without the need for laminectomy. Lateral hemisection is then performed with direct visible control under a microscope. The trauma is minimized, requiring only a small bone wound. 
This technique has several advantages: it is faster and, therefore, less of a burden for the animal, and the bone wound is smaller. Because the laminectomy is eliminated, there is less chance for unwanted injury to the spinal cord, and there are no bone splinters that can cause problems (bone splinters embedded in the spinal cord can cause swelling and secondary damage). The vertebral canal remains intact. The main limitation is that the hemisection can only be performed in the intervertebral spaces. 
The results show that this technique can be performed much faster than the traditional surgical approach, using laminectomy (11 min vs. 35 min). This technique can be useful for researchers working with animal models of open spinal cord injury as it is widely adaptable and does not require any additional specialized instrumentation.

Here, we describe a new, fast technique modeling open spinal cord injury in rats that eliminates laminectomy. Lateral hemisection is performed while viewing through a microscope. The technique is versatile and can also be used in the cervical, thoracic, and lumbar regions of the spinal cord of other animals.

ラットの開腹脊髄損傷をモデル化するための低侵襲で高速な脊髄外側半断面技術

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...