このプロトコールでは、電気生理学的特性を研究するために必要な最初のステップである精製された全長TRPチャネルを取得し、全長ショウジョウバエTRPチャネルの構造情報を得るための精製プロセスを実証します。INADタンパク質複合体のサンプリング機構に基づき、はるかに高い容量を有する低コストのニッケルビーズを使用して、十分な量のTRPチャネルをフライヘッドから精製することができる。手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるYuyang Liuです。
開始するために、pGEX 4T-1 TRP 1261-1265プラスミドを大腸菌BL21細胞に形質転換し、塩化カルシウムヒートショック形質転換法を用いた。10ミリリットルのルリアベルターニ培地に単一のコロニーを接種し、摂氏37度で一晩成長させる。10ミリリットルの播種培養物を1リットルのルリアベルターニ培地に加え、摂氏37度でインキュベートする。
細胞の光学密度が0.5に達したら、細胞を摂氏16度まで冷却し、0.1ミリモルのイソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシドを加える。過剰発現後、遠心分離により培養細胞1リットルのペレットを、40ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。再懸濁セルを高圧ホモジナイザーにロードし、摂氏4度に予冷する。
ホモジナイザーの圧力をゆっくりと800バールまで上げます。入口タブを開き、再懸濁されたセルを狭いスリットを備えたバルブに円形に通過させます。5ミリリットルのグルタチオンビーズを重力フローカラムにロードし、50ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水バッファーでビーズを合計3回洗浄します。
高圧ホモジナイザーから細胞溶解液を48、384回G.遠心分離した細胞溶解液の上清の約40ミリリットルを重力流カラム内の平衡化グルタチオンビーズに加え、摂氏4度で30分間インキュベートする。グルタチオンビーズを10分ごとに再懸濁する。30分間のインキュベーション後、カラム出口タブを開き、ビーズとフロースルー画分を分離した。
フロースルー画分を捨て、残りのグルタチオンビーズを50ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水緩衝液で2回すすいでください。グルタチオンビーズに15ミリリットルの溶出バッファーを加え、10分ごとにビーズを再懸濁した。GST タグ付き TRP 1261-1275 フラグメントを 50 mL 円錐管に溶かし、サイズ排除カラムにロードします。
溶出したタンパク質をチューブあたり5ミリリットル回収し、冷蔵遠心分離機で限外ろ過スピンカラムで遠心分離することにより精製断片を1ミリリットルに濃縮する。Hisタグ付きNORPA 863-1095フラグメントを精製するには、ニッケルビーズを使用して以前に実証した手順に従います。成体のハエを50ミリリットルの円錐形遠心管に集め、液体窒素中で10分間凍結する。
凍ったチューブを手で激しく振って、混合物を3つの、順番に積み重ねられた、予め冷却されたステンレス鋼のふるいに移す。ふるいを振り、ブラシを使用してフライヘッドを40メッシュのふるいから掃き落とします。それらを5ミリリットルの円錐形チューブに移し、マイナス80°Cで保管してください。
予め冷却された乳鉢と乳棒を使用して、液体窒素中の0.5グラムの頭を均質化する。ホモジナイズしたヘッドを5ミリリットルの10倍溶解バッファーに溶解し、続いて4°Cで20、817倍Gで20分間遠心分離した。スピンダウン上清をさらに4°Cで60分間Gで100,000倍に遠心分離する。
1ミリリットルのニッケルビーズを重力フローカラムに加え、10ミリリットルの二重蒸留水で4°Cでビーズを3回洗浄します。ビーズを10カラム容量の溶解バッファーで、摂氏 4 度で 3 回平衡化します。500マイクロリットルの精製Hisタグ付きNORPA 863-1095タンパク質をニッケルカラムに加え、カラムをインキュベートする。
ビーズを10分ごとに再懸濁します。カラム出口タップを開き、ビーズとフロースルー画分を分離し、ニッケルビーズを10ミリリットルの冷溶解バッファーで洗浄します。次いで、ショウジョウバエ頭部ホモジネートの冷上清をニッケルカラムに加える。
インキュベーション後、ビーズを10ミリリットルの溶解バッファーで洗浄し、500マイクロリットルの600マイクロモルGSTタグ付きTRP 1261-1275タンパク質をビーズに加えます。溶出画分を重力カラムから回収する。ニッケルビーズを10ミリリットルの結合バッファーで洗浄します。
次に、溶出バッファーを加え、重力フローカラムから溶出画分を回収します。ショウジョウバエTRPチャネル精製から溶出した画分を濃縮し、4ミリリットルの限外ろ過スピンカラムを使用した。サンプルをサイズ排除カラムに注入し、妥当な流速でタンパク質を溶出します。
GSTタグ付きTRP 1261-1275フラグメントを大腸菌細胞で発現させ、グルタチオンビーズおよびサイズ排除カラムを用いて精製した。同様に、Hisタグ付きNORPA 863−1095断片を、ニッケルビーズおよびサイズ排除カラムを用いて発現および精製した。溶出されたTRPチャネルを、サイズ排除クロマトグラフィーによって、過剰なGSTタグ付きTRP 1261〜1275ペプチドから分離する。
副産物として、INAD、ePKC、NORPA 863−1095複合体は、TRP 1261−1275ペプチド競合の後に得られる。このプロトコルを試みる際に覚えておくべき最も重要なことは、液体窒素中でフライヘッドを均質化し、DDMと呼ばれる洗剤を含む緩衝液中でホモジネートを解決することです。この手順に従って、INADタンパク質複合体全体を精製し、その組み立ておよび調節機構を研究するために使用することができる。
この方法の将来の潜在的な応用は、Cryo-EM技術を用いて内因性ショウジョウバエTRPチャネルの構造情報を研究することである。さらに、人工二重層脂質膜における精製された内因性ショウジョウバエTRPチャネルの電気生理学的特性を測定することも可能である。
