これは、単一細胞消化の有無にかかわらず、2つの異なる継代培養プロセスにおける食道腺癌オルガノイドの取り扱いを実証する、簡単で視覚化されたプロトコルです。EACオルガノイドを2つの異なる方法で再培養するための標準化されたプロトコルは、研究者がEAC PDOベースの実験において異なる下流アプリケーションに適した技術を選択するのを支援することができます。PDOを扱う際には、各ステップの詳細に注意を払うことが不可欠です。
チームベースのSOPは、PODの品質にとって非常に重要です。手順を実演するのは、博士課程の学生であるNing Bo Fanと研究室の技術アシスタントであるLisa Raatzの1人です。二酸化炭素を用いて摂氏37度で一晩インキュベートすることにより、12ウェルプレートを予温する。
利用可能な場合は、患者由来のオルガノイド培養物を含むプレートから空のウェルを使用してください。適量のECMゲルを氷上で1時間インキュベートして液化させる。細胞回収溶液を氷の上に置きます。
成長しているPDOを含むプレートをインキュベーターから取り外します。真空ポンプを用いて古い媒体を吸引する。氷冷細胞回収溶液のドームあたり500マイクロリットルをウェルに加える。
ECMゲルを数回上下にピペッティングして崩壊させ、広いオリフィスを備えた1,000マイクロリットルの先端を使用してECMゲルドームを小片に断片化します。最大 2 つのウェルから PDO、ECM ゲル、および細胞回収溶液を結合し、5 ミリリットルの低結合チューブに移します。このチューブを氷上で20分間インキュベートする。
チューブを反転させて5分ごとに混合する。チューブを500倍のGの速度で摂氏4度で4分間遠心分離する。目に見えるペレットがない場合は、ECMゲルPDO溶液を含む相に達するまで真空ポンプで上清を慎重に除去し、3ミリリットルの氷冷細胞回収溶液を加える。
チューブを数回反転させ、さらに10分間氷上でインキュベートする。500回Gで4分間、摂氏4度で遠心分離する。上清は、真空ポンプまたは1,000マイクロリットルのピペットを使用して慎重に廃棄します。
上澄み液はできるだけ取り除くようにしてください。PDOペレットを氷上に保管する。マイナス20°Cの冷凍庫から広いオリフィスで事前に冷却された201,000マイクロリットルの先端を取り出し、クリーンベンチに置きます。
播種予定のドームあたり50マイクロリットルのECMゲルと、さらに50マイクロリットルのエキストラを計算します。次いで、予め冷却された1,000マイクロリットルの先端を用いてペレットをECMゲルに再懸濁し、約10回上下にピペッティングして混合する。ドームを播種する前に、予め温めた12ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。
50マイクロリットルのECMゲルを含むドームを温かいプレートに播種する。プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で20〜30分間インキュベートし、ECMゲルを固化させた。ドームを乱すことなく、事前に温めたPDO培地を慎重に加えます。
播種されたPDOを顕微鏡下で監視する。必要な密度と形態が起こるまでPDOを7〜14日間培養する。2ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAと20マイクロリットルのDNAase Iを混合して消化培地を調製し、2つのウェルから採取したPDOを消化する。
予め調製したペレットを適量に予め加温した0.25%トリプシンEDTAおよびDNAase Iに再懸濁し、1,000マイクロリットルのピペットを用いて上下にピペッティングすることによって約10回混合する。最低28RPMの回転速度を有する回転インキュベーター中で摂氏37度で10分間インキュベートする。6ミリリットルの大豆トリプシン阻害剤溶液を含む15ミリリットルのチューブを準備する。
消化後、消化したPDOを1,000マイクロリットルのピペットで数回徹底的に混合してPDOを崩壊させます。消化されたPDOをSDI溶液を含む15ミリリットルのチューブに移し、消化を停止します。500回Gで4分間、摂氏4度で遠心分離する。
上清は、真空ポンプまたは1,000マイクロリットルのピペットを使用して慎重に廃棄します。ペレットを1ミリリットルの基礎培地に再懸濁する。自動細胞カウンターまたは血球計数器を使用して細胞濃度と生存率を決定します。
播種のために計画されたドームと1つの余分なドームに従って細胞数を計算し、それらを新鮮な1.5ミリリットルの低結合チューブに移す。500回Gで4分間、摂氏4度で遠心分離する。1,000マイクロリットルのピペットを使用して上清を慎重に廃棄する。
適量のECMゲルを、予め冷却された1,000マイクロリットル幅のオリフィス先端を用いてペレットに加える。上下約10回ピペッティングして混ぜる。消化したPDOを12ウェルプレートに播種する。
未消化PDOの凍結保存プロセスを、予め調製したペレットで開始する。500マイクロリットルの低温凍結培地を使用して、ペレットを2つのドームから再懸濁し、極低温バイアルに移す。適切な細胞凍結容器を使用して、冷凍庫でPDOを一晩凍結する。
凍結したPDOをマイナス150°Cの冷凍庫に移します。消化されたPDOの凍結保存のために、細胞を新鮮な1.5ミリリットルの低結合チューブに移す。500回Gで4分間、摂氏4度で遠心分離する。
上清は1,000マイクロリットルのピペットを使用して慎重に廃棄してください。ペレットを500マイクロリットルの凍結培地に再懸濁し、極低温バイアルに移す。適切な細胞凍結容器を使用して、PDOをマイナス80°Cの冷凍庫で一晩凍結し、長期保存のためにマイナス150°Cの冷凍庫に移します。
単一細胞消化なしで継代培養すると、同等の密度に達するのにかかる時間が短くなり、主にコンパクトな構造につながります。対照的に、単一細胞消化PDOは、中空コアを有する構造を示す。図は、コンパクトで中空構造のパラフィン包埋EAC PDOのヘマトキシリンエオジン染色および免疫組織化学染色を示しています。
パンサイトケラチンは、上皮腫瘍細胞の同定を可能にする。サイトケラチン7は腺分化腫瘍細胞を強調する。コンパクトな構造は主に未消化培養物に存在し、中空構造は単一細胞消化を受けた培養物において優勢である。
Ki67は、より高い細胞増殖を有する細胞集団を強調する。赤色のKi67と緑色のPanCKとは、EAC一次組織、EAC PDOコンパクト構造およびEAC PDO中空構造の間に同様に分布していた。この図は、単一細胞ベースの凍結保存と未消化のPDOベースの凍結保存による凍結ストックからの回収初日におけるEAC PDOの形態学的特徴を示しています。
事前に明確なサブカルチャー計画を立てることをお勧めします。温度制御と穏やかなピペッティングは、PDOを継代培養する際のECMゲルの正しい取り扱いに不可欠です。当社のプロトコルは、薬物スクリーニングアッセイ、フローサイトメトリー、組織学的分析などの下流分析のために、研究目的に応じてEAC PDOを維持するための実質的なものを研究者に提供します。
私たちの研究が、オルガノイドの研究者がオルガノイドの貯蔵と継代培養、特にトランスレーショナル研究における患者由来の材料の堅牢な結果について、迅速かつ容易な決定を下すのに役立つことを願っています。
