그것은 단일 세포 소화의 유무에 관계없이 두 가지 다른 계대 배양 과정에서 식도 선암종 오가노이드의 취급을 입증하는 쉽고 시각화 된 프로토콜입니다. EAC 오가노이드를 두 가지 방법으로 계대배양하기 위한 표준화된 프로토콜은 연구자들이 EAC PDO 기반 실험에서 서로 다른 다운스트림 응용에 적합한 기술을 선택하는 것을 지원할 수 있다. PDO를 다루는 동안 각 단계의 세부 사항에주의를 기울이는 것이 중요합니다.
팀 기반 SOP는 POD의 품질에 매우 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 박사 과정 학생 인 Ning Bo Fan과 실험실의 기술 조수 인 Lisa Raatz 중 하나가 될 것입니다. 이산화탄소를 사용하여 섭씨 37도에서 밤새 인큐베이션하여 12-웰 플레이트를 예열합니다.
가능한 경우, 환자 유래 오가노이드 배양이 있는 플레이트에서 빈 웰을 사용하십시오. 적절한 부피의 ECM 겔을 얼음 상에서 한 시간 동안 인큐베이션하여 액화시킨다. 세포 회수 용액을 얼음 위에 놓습니다.
인큐베이터에서 성장하는 PDO로 플레이트를 제거하십시오. 진공 펌프를 사용하여 오래된 매체를 흡인하십시오. 얼음 차가운 세포 회수 용액의 돔 당 500 마이크로 리터를 우물에 넣으십시오.
ECM 겔을 여러 번 위아래로 피펫팅하여 ECM 겔 돔을 넓은 오리피스가있는 1,000 마이크로 리터 팁을 사용하여 작은 조각으로 분해합니다. PDO, ECM 겔 및 세포 회수 용액을 최대 두 개의 웰에서 결합하고 다섯 밀리리터의 낮은 결합 튜브로 옮깁니다. 이 튜브를 얼음 위에서 20 분 동안 배양하십시오.
튜브를 뒤집어 다섯 분마다 혼합하십시오. 튜브를 섭씨 네 도에서 네 분 동안 500 배 G의 속도로 원심분리하십시오. 눈에 보이는 펠렛이 없으면 ECM 겔 PDO 용액을 함유 한 상에 도달 할 때까지 진공 펌프로 상층액을 조심스럽게 제거하고 세 밀리리터의 얼음 차가운 세포 회수 용액을 첨가하십시오.
튜브를 몇 번 뒤집고 얼음 위에서 10 분 동안 배양하십시오. 섭씨 네 도에서 네 분 동안 500배 G에서 원심분리한다. 상층액을 진공 펌프 또는 1, 000 마이크로리터 피펫을 사용하여 조심스럽게 버리십시오.
가능한 한 상청액을 제거하십시오. PDO 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. 영하 20도 냉동고에서 넓은 오리피스가있는 사전 냉각 된 201, 000 마이크로 리터 팁을 제거하고 깨끗한 벤치에 놓습니다.
시딩을 위해 계획된 돔 당 50 마이크로 리터의 ECM 젤과 50 마이크로 리터의 추가 용량을 계산하십시오. 이어서, 펠렛을 ECM 겔에 재현탁시키고 미리 냉각된 1, 000 마이크로리터 팁을 사용하여 약 10회 상하로 피펫팅하여 혼합한다. 돔을 시딩하기 전에 미리 가온된 12웰 플레이트를 인큐베이터에서 제거하십시오.
50 마이크로 리터의 ECM 젤이 들어있는 돔을 따뜻한 접시에 뿌립니다. 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션하여 ECM 겔을 응고시킨다. 돔을 방해하지 않고 미리 예열 된 PDO 배지를 조심스럽게 추가하십시오.
현미경으로 시드된 PDO를 모니터링합니다. 필요한 밀도 및 형태학이 발생할 때까지 7 내지 14일 동안 PDOs를 배양한다. 2밀리리터의 0.25%트립신 EDTA와 20마이크로리터의 DNAase I을 혼합하여 소화 배지를 준비하여 두 웰에서 수확한 PDO를 소화시킨다.
이전에 제조된 펠렛을 미리 가온된 0.25%트립신 EDTA 및 DNAase I의 적절한 부피에 재현탁시키고, 1, 000 마이크로리터 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 약 10회 혼합한다. 최소 28RPM의 회전 속도를 갖는 회전 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 10분 동안 인큐베이션한다. 여섯 밀리리터의 대두 트립신 억제제 용액을 함유하는 15밀리리터 튜브를 준비한다.
소화 후, 소화된 PDO를 1, 000 마이크로리터 피펫과 몇 번 완전히 섞어 PDO를 교란시킨다. 소화된 PDO를 SDI 용액이 들어있는 15밀리리터 튜브로 옮겨 소화를 중지시킵니다. 섭씨 네 도에서 네 분 동안 500배 G에서 원심분리한다.
상층액을 진공 펌프 또는 1, 000 마이크로리터 피펫을 사용하여 조심스럽게 버리십시오. 펠렛을 한 밀리리터의 기본 배지에 재현탁하십시오. 자동화된 세포 계수기 또는 혈구세포계를 사용하여 세포 농도와 생존율을 결정하십시오.
시드를 위해 계획된 돔에 따라 세포 수를 계산하고 여분의 돔 1 개를 계산하여 신선한 1.5 밀리리터 낮은 바인딩 튜브로 옮깁니다. 섭씨 네 도에서 네 분 동안 500배 G에서 원심분리한다. 1, 000 마이크로리터 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 버린다.
적절한 부피의 ECM 겔을 예비냉각된 1,000 마이크로리터 폭 오리피스 팁을 사용하여 펠렛에 첨가한다. 약 10 번 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오. 소화된 PDO를 이전에 입증된 대로 12웰 플레이트에 시드합니다.
이전에 준비된 펠릿으로 소화되지 않은 PDO의 냉동 보존 과정을 시작하십시오. 500 마이크로 리터의 냉간 냉동 매체를 사용하여 두 개의 돔에서 펠렛을 재현탁하여 극저온 바이알로 옮깁니다. 적절한 세포 동결 용기를 사용하여 냉동실에서 하룻밤 동안 PDO를 동결하십시오.
냉동 PDO를 영하 150도 냉동고로 옮깁니다. 소화된 PDO의 냉동 보존을 위해, 세포를 신선한 1.5밀리리터 낮은 결합 튜브로 옮깁니다. 섭씨 네 도에서 네 분 동안 500배 G에서 원심분리한다.
상층액을 1, 000 마이크로리터 피펫을 사용하여 조심스럽게 버리십시오. 펠렛을 500 마이크로리터의 동결 배지에 재현탁시키고 극저온 바이알로 옮긴다. 적절한 세포 냉동 용기를 사용하여 영하 80도 냉동고에서 하룻밤 사이에 PDO를 동결시키고 영하 150도 냉동고로 옮겨 장기간 보관하십시오.
단일 세포 소화없이 계대배양하는 것은 비교 가능한 밀도에 도달하는 데 더 적은 시간이 걸리고 주로 컴팩트 한 구조로 이어집니다. 대조적으로, 소화된 단일 세포 PDO는 중공 코어를 갖는 구조를 나타낸다. 도면은 콤팩트하고 중공 구조인 파라핀 포매된 EAC PDO의 헤마톡실린 에오신 염색 및 면역조직화학 염색을 보여준다.
판시토케라틴은 상피 종양 세포의 확인을 가능하게 한다. 시토케라틴 7은 선으로 분화된 종양 세포를 강조한다. 컴팩트 한 구조는 소화되지 않은 배양물에 주로 존재하는 반면, 중공 구조는 단일 세포 소화를 겪은 배양물에서 우세합니다.
Ki67은 세포 증식이 더 높은 세포 집단을 강조합니다. 적색의 Ki67과 녹색의 PanCK는 EAC 일차 조직, EAC PDO 컴팩트 구조 및 EAC PDO 중공 구조 사이에 유사하게 분포되었다. 이 그림은 단일 세포 기반 냉동 보존 및 소화되지 않은 PDO 기반 냉동 보존을 통해 냉동 재고에서 회복 첫날에 EAC PDO의 형태 학적 특성을 보여줍니다.
사전에 명확한 하위 문화 계획을 세우는 것이 좋습니다. 온도 제어와 부드러운 피펫팅은 PDO를 계대배양할 때 ECM 젤을 올바르게 취급하는 데 필수적입니다. 우리의 프로토콜은 연구자들에게 약물 스크리닝 분석, 유세포 분석 또는 조직학적 분석과 같은 하류 분석에 대한 연구 목적에 따라 EAC PDO를 유지할 수 있는 실질적인 것을 제공합니다.
우리는 우리의 연구가 오가노이드 연구자들이 오가노이드의 저장 및 하위 문화, 특히 번역 연구에서 환자 유래 물질의 강력한 결과에 대한 빠르고 쉬운 결정을 내리는 데 도움이되기를 바랍니다.
