É um protocolo fácil e visualizado que demonstra o manuseio de organoides de adenocarcinoma esofágico em dois processos diferentes de subcultura com e sem digestão unicelular. O protocolo padronizado para subculturar organoides EAC em dois métodos diferentes pode apoiar os pesquisadores na escolha de técnicas apropriadas para diferentes aplicações a jusante em seus experimentos baseados em PDO EAC. Ao lidar com PDOs, é essencial prestar atenção aos detalhes em cada etapa.
Um SOP baseado em equipe é crucial para a qualidade dos PODs. Demonstrando o procedimento será um dos nossos doutorandos Ning Bo Fan e Lisa Raatz, assistente técnica do laboratório. Pré-aquecimento uma placa de 12 poços por incubação durante a noite a 37 graus Celsius usando dióxido de carbono.
Se disponível, use poços vazios de uma placa com a cultura organoide derivada do paciente. Incubar um volume apropriado de gel ECM por uma hora no gelo para liquefazer. Coloque a solução de recuperação celular no gelo.
Remova a placa com PDOs em crescimento da incubadora. Aspirar o meio velho usando uma bomba de vácuo. Adicione 500 microliters por cúpula de solução de recuperação de células geladas no poço.
Desintegrem o gel ECM ao escoar várias vezes para fragmentar cúpulas de gel ECM em pequenos pedaços usando 1.000 pontas de microliter com um orifício largo. Combine a solução de PDO, gel ECM e recuperação celular a partir de um máximo de dois poços e transfira-o para um tubo de ligação baixa de cinco mililitros. Incubar este tubo no gelo por 20 minutos.
Misture a cada cinco minutos invertendo o tubo. Centrifugar o tubo a uma velocidade de 500 vezes G por quatro minutos a quatro graus Celsius. Se não houver pelota visível, remova cuidadosamente o sobrenante com uma bomba de vácuo até que a fase contendo a solução de PDO gel ECM seja atingida e adicione três mililitros de solução de recuperação de células geladas.
Inverta o tubo algumas vezes e incuba no gelo por mais 10 minutos. Centrifugar a 500 vezes G por quatro minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante cuidadosamente usando uma bomba de vácuo ou uma pipeta de 1.000 microliter.
Tente remover o supernatante o máximo possível. Armazene a pelota PDO no gelo. Remova as pontas de 201.000 microliteres pré-resfriados com um orifício largo do congelador de menos 20 graus Celsius e coloque-as em um banco limpo.
Calcule 50 microliters de gel ECM por cúpula planejada para semeadura, além de 50 microliters extras. Em seguida, resuspenque a pelota em gel ECM usando uma ponta de 1.000 microliter pré-resfriada e misture por pipetar para cima e para baixo cerca de 10 vezes. Remova a placa pré-aquecida de 12 poços da incubadora antes de semear as cúpulas.
Sementes as cúpulas contendo 50 microliters de gel ECM na placa quente. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 20 a 30 minutos para solidificar o gel ECM. Adicione cuidadosamente o meio PDO pré-aquecido sem perturbar as cúpulas.
Monitore PDOs semeados sob o microscópio. Cultura os PDOs por 7 a 14 dias até que ocorra a densidade e a morfologia necessárias. Prepare o meio de digestão misturando dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA e 20 microliters DNAase I para digerir PDOs colhidos de dois poços.
Resuspenha a pelota previamente preparada em um volume apropriado de edta e DNAase I pré-aquecidas e misture-a cerca de 10 vezes por pipetar para cima e para baixo usando uma pipeta de 1.000 microliter. Incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora rotativa com uma velocidade de rotação de no mínimo 28 RPM. Prepare um tubo de 15 mililitros contendo seis mililitros de solução inibidora de trippsina de soja.
Após a digestão, misture bem os PDOs digeridos algumas vezes com uma pipeta de 1.000 microliter para interromper os PDOs. Transfira os PDOs digeridos para o tubo de 15 mililitros contendo solução SDI para parar a digestão. Centrifugar a 500 vezes G por quatro minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o supernatante cuidadosamente usando uma bomba de vácuo ou uma pipeta de 1.000 microliter. Resuspenda a pelota em um mililitro de meio basal. Determine a concentração e a viabilidade celular usando um contador celular automatizado ou um hemócito.
Calcule o número do celular de acordo com as cúpulas planejadas para semeadura, mais uma cúpula extra, e transfira-as para um novo tubo de ligação baixa de 1,5 mililitro. Centrifugar a 500 vezes G por quatro minutos a quatro graus Celsius. Descarte cuidadosamente o supernascer usando uma pipeta de 1.000 microliter.
Adicione o volume apropriado de gel ECM à pelota usando uma ponta de orifício de 1.000 microliter. Misture por pipetting para cima e para baixo cerca de 10 vezes. Semente os PDOs digeridos em uma placa de 12 poços como demonstrado anteriormente.
Inicie o processo de criopreservação de PDOs não digeridos com pelotas previamente preparadas. Use 500 microliters de meio de congelamento frio para resuspensar a pelota de duas cúpulas e transferi-la para um frasco criogênico. Congele os PDOs durante a noite no congelador usando um recipiente de congelamento celular apropriado.
Transfira os PDOs congelados para um congelador de menos 150 graus Celsius. Para criopreservação de PDOs digeridos, transfira células para um tubo fresco de ligação baixa de 1,5 mililitro. Centrifugar a 500 vezes G por quatro minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o supernatante cuidadosamente usando uma pipeta de 1.000 microliter. Resuspenda a pelota em 500 microliters congelando médio e transfira-a para um frasco criogênico. Congele os PDOs durante a noite em um freezer de menos 80 graus Celsius usando um recipiente de congelamento de células apropriado e transfira-os para um freezer de menos 150 graus Celsius para armazenamento a longo prazo.
Subcultura sem digestão unicelular leva menos tempo para atingir densidade comparável e leva principalmente a estruturas compactas. Em contraste, os PDOs digeridos de célula única mostram estruturas com um núcleo oco. A figura mostra a coloração de eosina hematoxilina e a coloração imunohistoquímica de PDOs EAC embutidos em parafina com estruturas compactas e ocas.
A pancittokeratina permite a identificação de células tumorais epiteliais. A citokeratina 7 destaca as células tumorais diferenciadas glandulares. A estrutura compacta existe predominantemente na cultura não digerida, enquanto a estrutura oca é dominante na cultura que passou pela digestão unicelular.
O Ki67 destaca as populações celulares com maior proliferação celular. Os Ki67 em vermelho e PanCK em verde foram distribuídos da mesma forma entre o tecido primário EAC, a estrutura compacta EAC PDO e a estrutura oca EAC PDO. A figura mostra características morfológicas dos PDOs EAC no primeiro dia de recuperação do estoque congelado com criopreservação baseada em célula única e criopreservação baseada em PDO nãodigestrita.
Recomendamos fazer um plano de subcultura claro com antecedência. O controle de temperatura e a pipetação suave são essenciais para o manuseio correto dos géis ECM ao subculturar PDOs. Nosso protocolo fornece aos pesquisadores o substancial para manter seus PDOs EAC de acordo com seu propósito de estudo para análise a jusante, como ensaio de rastreamento de drogas, citometria de fluxo ou análise histológica.
Esperamos que nosso trabalho possa ajudar os pesquisadores organoides a tomar decisões rápidas e fáceis para o armazenamento e subcultura de organoides, particularmente para resultados robustos de materiais derivados do paciente em pesquisas translacionais.
