Es ist ein einfaches und visualisiertes Protokoll, das die Handhabung von Ösophagus-Adenokarzinom-Organoiden in zwei verschiedenen Subkulturprozessen mit und ohne Einzelzellverdauung demonstriert. Das standardisierte Protokoll zur Subkulturation von EAC-Organoiden in zwei verschiedenen Methoden kann Forscher bei der Auswahl geeigneter Techniken für verschiedene nachgelagerte Anwendungen in ihren EAC-PDO-basierten Experimenten unterstützen. Beim Umgang mit PDOs ist es wichtig, bei jedem Schritt auf die Details zu achten.
Eine teambasierte SOP ist entscheidend für die Qualität von PODs. Eines unserer Doktoranden Ning Bo Fan und Lisa Raatz, die Technikassistentin des Labors, werden das Verfahren demonstrieren. Vorwärmen Sie eine 12-Well-Platte durch Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Kohlendioxid.
Falls verfügbar, verwenden Sie leere Vertiefungen aus einer Platte mit der vom Patienten abgeleiteten Organoidkultur. Inkubieren Sie ein angemessenes Volumen ECM-Gel für eine Stunde auf Eis, um sich zu verflüssigen. Legen Sie die Zellwiederherstellungslösung auf Eis.
Entfernen Sie die Platte mit wachsenden PDOs aus dem Inkubator. Natives Medium mit einer Vakuumpumpe abpumpen. Geben Sie 500 Mikroliter pro Kuppel Eiskaltzellen-Rückgewinnungslösung in den Brunnen.
Zerlegen Sie das ECM-Gel, indem Sie mehrmals nach oben und unten pipettieren, um ECM-Gel-Kuppeln mit 1.000 Mikroliterspitzen mit einer breiten Öffnung in kleine Stücke zu fragmentieren. Kombinieren Sie die PDO-, ECM-Gel- und Zellrückgewinnungslösung aus maximal zwei Vertiefungen und übertragen Sie sie in ein fünf Milliliter niedriges Binderöhrchen. Inkubieren Sie diese Röhre 20 Minuten lang auf Eis.
Mischen Sie alle fünf Minuten, indem Sie die Röhre umkehren. Zentrifugieren Sie das Rohr mit einer Geschwindigkeit von 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius. Wenn kein sichtbares Pellet vorhanden ist, entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Vakuumpumpe, bis die Phase mit ECM-Gel-PDO-Lösung erreicht ist, und fügen Sie drei Milliliter Eiskaltzellen-Rückgewinnungslösung hinzu.
Drehen Sie die Röhre einige Male um und inkubieren Sie sie weitere 10 Minuten auf Eis. Zentrifuge bei 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Vakuumpumpe oder einer 1.000-Mikroliter-Pipette.
Versuchen Sie, den Überstand so weit wie möglich zu entfernen. Lagern Sie das DOP-Pellet auf Eis. Vorgekühlte 201.000 Mikroliter Spitzen mit breiter Öffnung aus dem minus 20 Grad Celsius Gefrierschrank nehmen und auf eine saubere Bank stellen.
Berechnen Sie 50 Mikroliter ECM-Gel pro Dome, die für die Aussaat geplant sind, plus 50 Mikroliter extra. Dann suspendieren Sie das Pellet in ECM-Gel mit einer vorgekühlten 1.000-Mikroliter-Spitze und mischen Sie es durch Pipettieren auf und ab etwa 10 Mal. Entfernen Sie die vorgewärmte 12-Well-Platte aus dem Inkubator, bevor Sie die Kuppeln säen.
Samen Sie die Kuppeln mit 50 Mikrolitern ECM-Gel in die warme Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 20 bis 30 Minuten, um das ECM-Gel zu verfestigen. Vorgewärmtes DOP-Medium vorsichtig hinzufügen, ohne die Kuppeln zu stören.
Überwachen Sie gesetzte PDOs unter dem Mikroskop. Kultur der PDOs für 7 bis 14 Tage, bis die erforderliche Dichte und Morphologie auftreten. Bereiten Sie das Verdauungsmedium vor, indem Sie zwei Milliliter 0,25% Trypsin EDTA und 20 Mikroliter DNAase I mischen, um PDOs aus zwei Vertiefungen zu verdauen.
Resuspendiert das zuvor vorbereitete Pellet in einem geeigneten Volumen von vorerwärmten 0,25% Trypsin EDTA und DNAase I und mischen Sie es etwa 10 Mal, indem Sie es mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem rotierenden Inkubator mit einer Drehzahl von mindestens 28 U / min. Bereiten Sie ein 15-Milliliter-Röhrchen mit sechs Millilitern Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor-Lösung vor.
Mischen Sie die verdauten PDOs nach der Verdauung einige Male gründlich mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette, um die PDOs zu stören. Übertragen Sie die verdauten PDOs in das 15-Milliliter-Röhrchen mit SDI-Lösung, um die Verdauung zu stoppen. Zentrifuge bei 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Vakuumpumpe oder einer 1.000-Mikroliter-Pipette. Resuspendiert das Pellet in einem Milliliter Basalmedium. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und -lebensfähigkeit mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer.
Berechnen Sie die Zellzahl entsprechend den für die Aussaat geplanten Kuppeln plus einer Kuppel extra und übertragen Sie sie auf ein frisches 1,5-Milliliter-Low-Bind-Rohr. Zentrifuge bei 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette.
Fügen Sie dem Pellet mit einer vorgekühlten 1.000 Mikroliter breiten Öffnungsspitze ein geeignetes Volumen ECM-Gel hinzu. Mischen Sie, indem Sie etwa 10 Mal auf und ab pipettieren. Samen Sie die verdauten PDOs in eine 12-Well-Platte, wie zuvor gezeigt.
Starten Sie den Kryokonservierungsprozess von unverdauten PDOs mit zuvor vorbereiteten Pellets. Verwenden Sie 500 Mikroliter kaltes Gefriermedium, um das Pellet aus zwei Kuppeln zu resuspendieren und in eine kryogene Durchstechflasche zu überführen. Einfrieren Sie PDOs über Nacht im Gefrierschrank mit einem geeigneten Zellgefrierbehälter.
Die eingefrorenen PDOs in einen Gefrierschrank von minus 150 Grad Celsius geben. Zur Kryokonservierung von verdauten PDOs werden die Zellen in ein frisches 1,5-Milliliter-Low-Bind-Röhrchen übertragen. Zentrifuge bei 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer 1.000 Mikroliter Pipette. Resuspendiert das Pellet in 500 Mikroliter Gefriermedium und überträgt es auf ein kryogenes Fläschchen. Einfrieren Sie PDOs über Nacht in einem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank mit einem geeigneten Zellgefrierbehälter ein und geben Sie sie zur Langzeitlagerung in einen minus 150 Grad Celsius Gefrierschrank.
Subkulturen ohne Einzelzellverdauung benötigen weniger Zeit, um eine vergleichbare Dichte zu erreichen, und führen hauptsächlich zu kompakten Strukturen. Im Gegensatz dazu zeigen die einzelligen verdauten PDOs Strukturen mit einem hohlen Kern. Die Abbildung zeigt die Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Immunhistochemie-Färbung von paraffineingebetteten EAC-PDOs mit kompakten und hohlen Strukturen.
Das Pancytokeratin ermöglicht die Identifizierung von epithelialen Tumorzellen. Das Cytokeratin 7 hebt die drüsendifferenzierten Tumorzellen hervor. Die kompakte Struktur existiert überwiegend in der unverdauten Kultur, während die hohle Struktur in der Kultur, die einer Einzelzellverdauung unterzogen wurde, dominant ist.
Der Ki67 hebt die Zellpopulationen mit höherer zellulärer Proliferation hervor. Die Ki67 in Rot und PanCK in Grün waren ähnlich auf EAC-Primärgewebe, EAC-PDO-Kompaktstruktur und EAC-PDO-Hohlstruktur verteilt. Die Abbildung zeigt morphologische Merkmale von EAC-PDOs am ersten Tag der Erholung aus gefrorenen Beständen mit einzelliger Kryokonservierung und unverdauter PDO-basierter Kryokonservierung.
Wir empfehlen, im Voraus einen klaren Subkulturplan zu erstellen. Temperaturregelung und schonendes Pipettieren sind für die korrekte Handhabung von ECM-Gelen bei der Subkulturation von PDOs unerlässlich. Unser Protokoll bietet Forschern die Möglichkeit, ihre EAC-PDOs entsprechend ihrem Studienzweck für nachgelagerte Analysen wie Arzneimittel-Screening-Assay, Durchflusszytometrie oder histologische Analyse aufrechtzuerhalten.
Wir hoffen, dass unsere Arbeit Organoidforschern helfen könnte, schnelle und einfache Entscheidungen für die Speicherung und Subkultur von Organoiden zu treffen, insbesondere für robuste Ergebnisse von patientenabgeleiteten Materialien in der translationalen Forschung.
