Özofagus adenokarsinom organoidlerinin tek hücreli sindirimli ve sindirimsiz iki farklı alt kültür sürecinde ele alındığını gösteren kolay ve görselleştirilmiş bir protokoldür. EAC organoidlerini iki farklı yöntemle alt kültüre almak için standartlaştırılmış protokol, araştırmacıların EAC PDO tabanlı deneylerinde farklı aşağı akış uygulamaları için uygun teknikleri seçmelerini destekleyebilir. PDO'larla uğraşırken, her adımda ayrıntılara dikkat etmek önemlidir.
Ekip tabanlı bir SÇP, POD'ların kalitesi açısından çok önemlidir. Prosedürü gösteren, doktora öğrencimiz Ning Bo Fan ve laboratuvarın teknik asistanı Lisa Raatz'dan biri olacak. 12 kuyulu bir plakayı, karbondioksit kullanarak 37 santigrat derecede gece boyunca inkübasyonla önceden ısıtın.
Varsa, hasta kaynaklı organoid kültüre sahip bir plakadan boş kuyucuklar kullanın. Sıvılaştırmak için buz üzerinde bir saat boyunca uygun miktarda ECM jeli inkübe edin. Hücre kurtarma solüsyonunu buzun üzerine yerleştirin.
Büyüyen PDO'larla plakayı inkübatörden çıkarın. Bir vakum pompası kullanarak eski ortamı aspire edin. Buz gibi soğuk hücre geri kazanım çözeltisinin kubbesi başına 500 mikrolitreyi kuyuya ekleyin.
ECM jel kubbelerini geniş delikli 1.000 mikrolitrelik uçlar kullanarak küçük parçalara ayırmak için ECM jelini birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek parçalayın. PDO, ECM jeli ve hücre geri kazanım solüsyonunu en fazla iki kuyucuktan birleştirin ve beş mililitrelik düşük bağlanmalı bir tüpe aktarın. Bu tüpü 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
Tüpü ters çevirerek her beş dakikada bir karıştırın. Tüpü dört santigrat derecede dört dakika boyunca 500 kat G hızında santrifüj yapın. Görünür bir pelet yoksa, ECM jel PDO çözeltisi içeren faza ulaşılana kadar süpernatantı bir vakum pompasıyla dikkatlice çıkarın ve üç mililitre buz gibi soğuk hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin.
Tüpü birkaç kez ters çevirin ve 10 dakika daha buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Dört santigrat derecede dört dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj. Süpernatantı bir vakum pompası veya 1.000 mikrolitrelik pipet kullanarak dikkatlice atın.
Süpernatantı mümkün olduğunca çıkarmaya çalışın. PDO peletini buz üzerinde saklayın. Önceden soğutulmuş 201.000 mikrolitrelik uçları eksi 20 santigrat derece dondurucudan geniş bir delikle çıkarın ve temiz bir tezgaha yerleştirin.
Tohumlama için planlanan kubbe başına 50 mikrolitre ECM jeli ve ayrıca 50 mikrolitre ekstra hesaplayın. Daha sonra önceden soğutulmuş 1.000 mikrolitrelik bir uç kullanarak peleti ECM jelinde yeniden askıya alın ve yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Kubbeleri tohumlamadan önce önceden ısıtılmış 12 delikli plakayı inkübatörden çıkarın.
50 mikrolitre ECM jeli içeren kubbeleri ılık plakaya tohumlayın. ECM jelini katılaştırmak için plakayı 37 santigrat derecede ve 20 ila 30 dakika boyunca% 5 karbondioksitte inkübe edin. Kubbeleri rahatsız etmeden önceden ısıtılmış PDO ortamını dikkatlice ekleyin.
Tohumlanmış PDO'ları mikroskop altında izleyin. Gerekli yoğunluk ve morfoloji oluşana kadar PDO'ları 7 ila 14 gün boyunca kültürleyin. İki kuyudan toplanan PDO'ları sindirmek için iki mililitre% 0.25 tripsin EDTA ve 20 mikrolitre DNAaz I karıştırarak sindirim ortamı hazırlayın.
Önceden hazırlanmış peleti, önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin EDTA ve DNAaz I'in uygun bir hacminde askıya alın ve 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetle çekerek yaklaşık 10 kez karıştırın. En az 28 RPM dönme hızına sahip dönen bir inkübatörde 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Altı mililitre soya fasulyesi tripsin inhibitörü çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir tüp hazırlayın.
Sindirimden sonra, PDO'ları bozmak için sindirilmiş PDO'ları 1.000 mikrolitrelik bir pipetle birkaç kez iyice karıştırın. Sindirimi durdurmak için sindirilmiş PDO'ları SDI çözeltisi içeren 15 mililitrelik tüpe aktarın. Dört santigrat derecede dört dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj.
Süpernatantı bir vakum pompası veya 1.000 mikrolitrelik pipet kullanarak dikkatlice atın. Peleti bir mililitre bazal ortamda yeniden askıya alın. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu ve canlılığını belirleyin.
Hücre numarasını, tohumlama için planlanan kubbelere ve ayrıca bir kubbe ekstrasına göre hesaplayın ve bunları taze bir 1,5 mililitrelik düşük bağlama tüpüne aktarın. Dört santigrat derecede dört dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj. Süpernatantı 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak dikkatlice atın.
Önceden soğutulmuş 1.000 mikrolitre genişliğinde bir delik ucu kullanarak pelete uygun miktarda ECM jeli ekleyin. Yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın. Sindirilmiş PDO'ları daha önce gösterildiği gibi 12 kuyucuklu bir plakaya tohumlayın.
Sindirilmemiş PDO'ların kriyoprezervasyon işlemine önceden hazırlanmış pelet ile başlanır. Peleti iki kubbeden uzaklaştırmak ve kriyojenik bir şişeye aktarmak için 500 mikrolitre soğuk dondurma ortamı kullanın. Uygun bir hücre dondurma kabı kullanarak PDO'ları dondurucuda gece boyunca dondurun.
Dondurulmuş PDO'ları eksi 150 santigrat derece dondurucuya aktarın. Sindirilmiş PDO'ların kriyoprezervasyonu için, hücreleri taze 1.5 mililitrelik düşük bağlanmalı bir tüpe aktarın. Dört santigrat derecede dört dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj.
Süpernatantı 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak dikkatlice atın. Peleti 500 mikrolitre dondurucu ortamda yeniden askıya alın ve kriyojenik bir şişeye aktarın. Uygun bir hücre dondurma kabı kullanarak PDO'ları eksi 80 santigrat derece dondurucuda gece boyunca dondurun ve uzun süreli depolama için eksi 150 santigrat derece dondurucuya aktarın.
Tek hücreli sindirim olmadan alt kültürleme, karşılaştırılabilir yoğunluğa ulaşmak için daha az zaman alır ve esas olarak kompakt yapılara yol açar. Buna karşılık, tek hücreli sindirilmiş PDO'lar içi boş bir çekirdeğe sahip yapılar gösterir. Şekil, kompakt ve içi boş yapılara sahip parafin gömülü EAC PDO'ların hematoksilin eozin boyama ve immünohistokimya boyamasını göstermektedir.
Pansitokeratin, epitel tümör hücrelerinin tanımlanmasını sağlar. Sitokeratin 7, glandüler diferansiye tümör hücrelerini vurgular. Kompakt yapı ağırlıklı olarak sindirilmemiş kültürde bulunurken, içi boş yapı tek hücreli sindirime tabi tutulan kültürde baskındır.
Ki67, daha yüksek hücresel proliferasyona sahip hücre popülasyonlarını vurgulamaktadır. Kırmızı renkte Ki67 ve yeşil renkte PanCK, EAC birincil dokusu, EAC PDO kompakt yapısı ve EAC PDO içi boş yapısı arasında benzer şekilde dağılmıştır. Şekil, tek hücreli kriyoprezervasyon ve sindirilmemiş PDO bazlı kriyoprezervasyon ile dondurulmuş stoktan iyileşmenin ilk gününde EAC PDO'ların morfolojik özelliklerini göstermektedir.
Önceden net bir alt kültür planı yapmanızı öneririz. Sıcaklık kontrolü ve nazik pipetleme, PDO'ları alt kültüre alırken ECM jellerinin doğru şekilde kullanılması için gereklidir. Protokolümüz, araştırmacılara EAC PDO'larını ilaç tarama testi, akış sitometrisi veya histolojik analiz gibi aşağı akış analizleri için çalışma amaçlarına göre sürdürmeleri için önemli bilgiler sağlar.
Çalışmamızın, organoid araştırmacıların organoidlerin depolanması ve alt kültürü için, özellikle de translasyonel araştırmalarda hasta kaynaklı materyallerin sağlam sonuçları için hızlı ve kolay kararlar almalarına yardımcı olabileceğini umuyoruz.
