このプロトコールは、大量インヒビターおよび大腿動脈凝固の投与を用いてマウス足パッド壊疽モデルを作成する方法を提示する。DiI灌流は、フットパッド血管系の高解像度可視化を可能にする。このモデルは臨床的に関連性があり、前臨床薬物検査および四肢虚血の研究に使用することができる。
血管系の高解像度可視化は、新生血管形成を評価するための技術的に容易な手段を提供する。この足パッド壊疽モデルは、末梢動脈疾患および重篤な四肢虚血の前臨床研究において重要な用途を有する。DiI灌流は、動物モデルにおける新生血管形成を研究するための有用なツールである。
この手順を実演するのは、外科研修医のアントワーヌ・リビエラスと、私の研究室の助手であるユレクシ・オルティスです。まず、使用直前に10ミリリットルの作業希釈液に200マイクロリットルのDiIストック溶液を加えてDiI作業溶液を作る。よく混ぜるために手で振る。
2つまたは3つの3方向活栓と25ゲージのバタフライニードルを直列に接続します。4ミリリットルのPBS、10ミリリットルのDiI溶液、および10ミリリットルの10%中性緩衝ホルマリンを含む10ミリリットルのシリンジを準備する。ホルマリンを含むシリンジを近位流入口に接続し、溶液を注入してラインから空気を流す。
次に、活栓を回してポートを閉じます。同じ手順を繰り返し、DiIとPBSでシリンジをそれぞれ中央および遠位の流入ポートに接続します。安楽死後、動物を吸収パッドの上で仰臥位に置き、腋窩と下肢を針で固定します。
はさみを使用して横切開を行い、腹腔を開き、左右の横隔膜を露出させて分割して胸腔にアクセスします。胸骨の両側の胸壁を下肋骨から第1または第2の肋骨に切断する。胸骨の下端をつかみ、それを動物の頭に向かって反射させて胸腔を露出させるために止血剤を使用してください。
右心室よりも色が明るく見える左心室を特定します。鈍い鉗子で心臓を優しくつかみ、蝶の針を左心室に挿入します。はさみまたは18ゲージの針を使用して右心房を穿刺し、血液と灌流溶液を心臓に戻して排出できるようにします。
PBSでシリンジのポートを開き、血管系から血液を洗い流すために、毎分1〜2ミリリットルの割合で2〜4ミリリットルを手動で1〜2分間注入する。右心房からの出血を観察することによって、正常な灌流を確実にする。注射後、PBSシリンジのポートを閉じます。
DiIでシリンジのポートを開き、毎分1〜2ミリリットルの割合で5〜10ミリリットルを5分間注入する。注射後、DiIシリンジのポートを閉じ、固定液の注入前に色素の混入を可能にするために2分間待つ。ホルマリンでシリンジのポートを開き、5〜10ミリリットルを毎分1〜2ミリリットルの割合で5分間注入する。
注射後、左心室から針を取り外します。重いはさみを使用して、足首の脛骨を脱臼させ、左右の足を下肢から完全に分離します。採取した足を1〜2ミリリットルの10%ホルマリン溶液で12ウェルプレートに入れます。
プレートをホイルで包み、一晩摂氏4度で保管してください。翌日、12ウェルプレート内の固定液を1ウェルあたり1〜2ミリリットルのPBSと交換する。足の足底と背部にメスで縦切開を行います。
次に、歯付きの鉗子と小さな止血剤を使用して、足と数字からすべての皮膚を慎重に取り除き、基礎となる軟部組織を傷つけないようにします。組織を取り付けるには、2つのガラス顕微鏡スライドの間に足を個別に置き、発泡生検パッドを両端に折り畳みます。2つの小さなバインダークリップを使用して、スライドガラスを両端で一緒に圧縮します。
あるいは、フットパッドを1~2ミリリットルのPBSを含む12ウェルプレートに戻します。ホイルで覆った後、4°Cで保管し、最大1ヶ月間蛍光を維持します。イメージングシステムの電源を入れ、集録ソフトウェアを起動し、低倍率または低開口率の対物レンズを使用して画像をキャプチャします。
「はい」をクリックして、ステージのアクティブ化ダイアログ・ボックスを表示します。[構成]タブで561ナノメートルレーザーをアクティブにします。メイン画面で、可視ボタンをクリックして可視ビームパスをアクティブにします。
検出器を570~600ナノメートルの範囲に設定するには、対応するアクティブなチェックボックスをクリックします。[取得]タブでタイルスキャンアイコンを選択し、目的の解像度を設定します。スライドガラス間で圧縮されたドライマウントされた組織サンプルを顕微鏡ステージ上の位置に配置し、組織に焦点を合わせます。
サンプルの片隅に移動します。タイルスキャンメニューの下で、マーク位置ボタンをクリックします。反対側のコーナーに移動し、マーク位置ボタンをもう一度クリックしてスキャン境界を設定します。
Zスタックの深さを設定するには、ライブボタンをクリックします。サンプルの中央に移動し、Z 軸ノブを使用してサンプルの一番下までスクロールします。Zスタックメニューの下にある取得タブで、開始ボタンをクリックします。
サンプルの上部までスクロールし、終了ボタンをクリックします。Z ステップ サイズをクリックし、目的の値に設定します。次に、[開始]をクリックして画像取得を開始します。
図は、手術後1週間でこのモデルから予想される組織喪失の変動を示しており、各画像の右下隅にFABERスコアが記録されています。再構成顕微鏡画像は、手術後5日後に結紮後肢のフットパッドへの灌流がひどく減少したのと比較して、非結紮対照フットパッドにおける正常な血管解剖学を明らかにする。手術後20日目に、足パッドへの灌流は有意に改善したが、非結紮対照の程度ではない。
このビデオは、サーフェス レンダリングがアニメーション機能を使用して作成されたことを示しています。灌流アセンブリからすべての気泡を洗い流します。灌流中に肺が膨張してピンク色に変わった場合、針は右心室を貫通しており、わずかに引っ込められるべきです。
四肢組織は、筋肉壊死、組織再生、血管密度、および前駆細胞、および他の組織修復細胞の動員を評価するための免疫染色に使用することができる。このマウス壊疽モデルにおけるDiI灌流の技術は、遺伝子および細胞療法の研究に使用されている。この研究は、重篤な四肢虚血患者の四肢における灌流を改善することを目的としている。
