В этом протоколе представлено, как создать модель гангрены подушечки стопы мыши с использованием введения ингибитора массы и коагуляции бедренной артерии. Затем перфузия DiI позволяет визуализировать сосудистую подушечку стопы с высоким разрешением. Эта модель клинически значима и может быть использована для доклинического тестирования лекарств и для изучения ишемии конечностей.
Визуализация сосудов с высоким разрешением предлагает технически легкое средство оценки неоваскуляризации. Эта модель гангрены подушечек стопы имеет важное применение в доклинических исследованиях заболеваний периферических артерий и критической ишемии конечностей. Перфузия DiI является полезным инструментом для изучения неоваскуляризации на животных моделях.
Демонстрировать процедуру будут Антуан Рибьерас, хирург-резидент, и Юлекси Ортис, научный сотрудник из моей лаборатории. Во-первых, сделайте рабочий раствор DiI, добавив 200 микролитров раствора DiI на 10 миллилитров рабочего раствора разбавителя непосредственно перед использованием. Встряхните вручную, чтобы хорошо перемешать.
Соедините два или три трехсторонних запорных крана и иглу бабочки 25 калибра последовательно. Приготовьте 10-миллилитровые шприцы с четырьмя миллилитрами PBS, 10 миллилитрами раствора DiI и 10 миллилитрами 10% нейтрального буферизованного формалина. Подключите шприц с формалином к проксимальному входному отверстию и введите раствор для промывки воздуха из линии.
Затем поверните запорный кран, чтобы закрыть порт. Повторите ту же процедуру, соединив шприцы с DiI, а затем PBS со средним и дистальным портами притока соответственно. После эвтаназии поместите животное в положение лежа на спине на абсорбирующей подушечке и закрепите подмышечные и нижние конечности иглами.
С помощью ножниц сделайте поперечный разрез, чтобы открыть брюшную полость, затем обнажите и разделите левую и правую диафрагму для доступа к грудной полости. Отрежьте стенку грудной клетки по обе стороны грудины от нижних ребер до первого или второго ребер. Используйте гемостат, чтобы захватить нижний конец грудины и отразить его к голове животного, чтобы обнажить грудную полость.
Определите левый желудочек, который выглядит светлее по цвету, чем правый. Осторожно обхватите сердце тупыми щипцами и вставьте иглу бабочки в левый желудочек. Используйте ножницы или иглу 18 калибра, чтобы проколоть правое предсердие, позволяя крови и перфузионным растворам возвращаться в сердце для дренажа.
Откройте порт шприца с помощью PBS и вручную вводите от двух до четырех миллилитров со скоростью от одного до двух миллилитров в минуту в течение одной-двух минут, чтобы вымыть кровь из сосудистой системы. Обеспечьте успешную перфузию, наблюдая кровотечение из правого предсердия. После инъекции закройте порт шприца PBS.
Откройте порт шприца с помощью DiI и введите от пяти до 10 миллилитров со скоростью от одного до двух миллилитров в минуту в течение пяти минут. После инъекции закройте порт шприца DiI и подождите две минуты, чтобы можно было внести краситель перед инъекцией фиксатора. Откройте отверстие шприца формалином и введите от пяти до 10 миллилитров со скоростью от одного до двух миллилитров в минуту в течение пяти минут.
После инъекции извлеките иглу из левого желудочка. С помощью тяжелых ножниц вывихните большеберцовую кость на лодыжке, полностью отделив левую и правую ступни от голени. Поместите собранные ножки в 12-луночную пластину с одним-двумя миллилитрами 10%-ного раствора формалина.
Оберните тарелку фольгой и храните при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день замените фиксирующий раствор в 12-луночной пластине на один-два миллилитра PBS на лунку. Сделайте продольный разрез скальпелем на подошвенной и спинной части стопы.
Затем с помощью зубчатых щипцов и небольшого гемостата аккуратно удалить всю кожу с стопы и пальцев, не повреждая подлежащие мягкие ткани. Чтобы смонтировать ткани, индивидуально поместите ножки между двумя стеклянными предметными стеклами микроскопа с пенопластовой биопсийной прокладкой, сложенной над собой на каждом конце. Используйте два небольших зажима для связующего, чтобы сжать стеклянные слайды вместе на каждом конце.
В качестве альтернативы можно вернуть ножную подушечку на пластину из 12 лунок с одним-двумя миллилитрами PBS. После покрытия фольгой храните его при четырех градусах Цельсия, чтобы поддерживать флуоресценцию до одного месяца. Включите систему обработки изображений, запустите программное обеспечение для сбора и используйте объектив с низким увеличением или низкой числовой диафрагмой для захвата изображений.
Нажмите кнопку Да в диалоговом окне активации этапа. Активируйте 561-нанометровый лазер на вкладке конфигурации. На главном экране активируйте видимый путь луча, нажав на видимую кнопку.
Установите детектор в диапазоне от 570 до 600 нанометров, нажав на соответствующий активный флажок. Выберите значок сканирования плитки на вкладке получения и установите требуемое разрешение. Поместите сухой установленный образец ткани, сжатый между стеклянными предметными стеклами, на ступень микроскопа и поместите ткань в фокус.
Перейдите в один из углов образца. В меню сканирования плитки нажмите на кнопку положения метки. Перейдите в противоположный угол и нажмите на кнопку положения отметки еще раз, установив границы сканирования.
Чтобы установить глубину Z-стека, нажмите на кнопку live. Перейдите к центру образца и с помощью ручки оси Z прокрутите до нижней части образца. На вкладке приобретения в меню Z-stack нажмите кнопку «Начало».
Прокрутите до верхней части образца и нажмите кнопку конца. Нажмите на размер z-шага и установите нужное значение. Затем нажмите «Пуск», чтобы начать получение изображения.
На рисунке показаны вариации потери тканей, которые можно ожидать от этой модели через неделю после операции, с оценками FABER, записанными в правом нижнем углу каждого изображения. Изображения реконструктивной микроскопии показывают нормальную анатомию сосудов в нелигированной контрольной подушечке стопы по сравнению с сильно уменьшенной перфузией в подушечке стопы перевязанного заднего скольжения через пять дней после операции. Через 20 дней после операции перфузия в подушечку стопы значительно улучшилась, хотя и не до степени нелигированного контроля.
На видео показано, что рендеринг поверхности был создан с использованием функции анимации. Смывайте все пузырьки воздуха из перфузионного узла. Если легкие расширяются и становятся розовыми во время перфузии, игла проникла в правый желудочек и должна быть слегка втянута.
Ткани конечностей могут быть использованы для иммуноокрашивания для оценки мышечного некроза, регенерации тканей, плотности сосудов и набора клеток-предшественников и других клеток восстановления тканей. Метод перфузии DiI в этой модели гангрены мышей использовался в исследованиях генной и клеточной терапии. Исследование направлено на улучшение перфузии в конечностях пациентов с критической ишемией конечностей.
