이 프로토콜은 질량 억제제 및 대퇴골 동맥 응고의 투여를 사용하여 마우스 발 패드 괴저 모델을 만드는 방법을 제시한다. 그런 다음 DiI 관류는 발 패드 혈관 구조의 고해상도 시각화를 허용합니다. 이 모델은 임상적으로 관련이 있으며 전임상 약물 검사 및 사지 허혈 연구에 사용할 수 있습니다.
혈관구조의 고해상도 시각화는 신생혈관화를 평가하는 기술적으로 쉬운 수단을 제공합니다. 이 발 패드 괴저 모델은 말초 동맥 질환 및 중요한 사지 허혈의 전임상 연구에 중요한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. DiI 관류는 동물 모델에서 신생혈관화를 연구하는데 유용한 도구이다.
이 절차를 시연하는 것은 외과 레지던트의 Antoine Ribieras와 내 실험실의 연구원 인 Yulexi Ortiz가 될 것입니다. 먼저, 사용 직전에 작업 희석액 10 밀리리터에 DiI 원액 200 마이크로리터를 첨가하여 DiI 작업 용액을 만듭니다. 잘 섞이기 위해 손으로 흔든다.
두 개 또는 세 개의 세 개의 방향 스톱콕과 25게이지 나비 바늘을 직렬로 연결합니다. 4 밀리리터의 PBS, 10 밀리리터의 DiI 용액 및 10 밀리리터의 10 % 중성 완충 포르말린으로 10 밀리리터 주사기를 준비하십시오. 포르말린으로 주사기를 근위 유입 포트에 연결하고 용액을 주입하여 라인에서 공기를 플러시하십시오.
그런 다음 스톱콕을 돌려 포트를 닫습니다. 동일한 절차를 반복하여 주사기를 DiI와 연결한 다음 PBS를 각각 중간 및 원위 유입 포트에 연결합니다. 안락사 후, 동물을 흡수 패드의 수핀 위치에 놓고 바늘로 겨드랑이와 하지를 고정하십시오.
가위를 사용하여 횡단 절개를 만들어 복강을 연 다음 좌우 횡격막을 노출시키고 나누어 흉강에 접근하십시오. 흉골의 양쪽에있는 흉벽을 아래쪽 갈비뼈에서 첫 번째 또는 두 번째 갈비뼈로 자릅니다. 지혈제를 사용하여 흉골의 하단을 잡고 동물의 머리 쪽으로 반사하여 흉강을 노출시킵니다.
오른쪽보다 색상이 밝게 보이는 좌심실을 확인하십시오. 무딘 포셉으로 심장을 부드럽게 잡고 나비 바늘을 좌심실에 삽입하십시오. 가위 또는 18게이지 바늘을 사용하여 오른쪽 심방을 뚫어 혈액과 관류 용액이 심장으로 돌아가 배출되도록 합니다.
PBS로 주사기의 포트를 열고 수동으로 혈관 시스템에서 혈액을 플러시하기 위해 분당 한 두 밀리리터에서 두 밀리리터의 속도로 분당 두 밀리리터를 주입합니다. 오른쪽 심방에서 출혈을 관찰하여 성공적인 관류를 보장하십시오. 주사 후, PBS 주사기의 포트를 닫는다.
DiI로 주사기의 포트를 열고 5 분 동안 분당 1 ~ 2 밀리리터의 속도로 다섯 ~ 10 밀리리터를 주입하십시오. 주사 후, DiI 주사기의 포트를 닫고 고정제를 주입하기 전에 염료의 혼입을 허용하기 위해 두 분 동안 기다리십시오. 포르말린으로 주사기의 포트를 열고 5 분 동안 분당 1 ~ 2 밀리리터의 속도로 다섯 ~ 10 밀리리터를 주입하십시오.
주사 후 좌심실에서 바늘을 제거하십시오. 무거운 가위를 사용하여 발목의 경골을 탈구하여 왼쪽 발과 오른쪽 발을 다리 아래에서 완전히 분리하십시오. 수확 한 발을 12 웰 플레이트에 10 % 포르말린 용액 1 ~ 2 밀리리터로 놓습니다.
접시를 호일로 감싸고 하룻밤 사이에 섭씨 네 도에 보관하십시오. 다음날, 12 웰 플레이트의 고정 용액을 웰 당 1 ~ 2 밀리리터의 PBS로 교체하십시오. 발바닥과 등쪽 부분에 메스가있는 세로 절개를하십시오.
그런 다음 치아가있는 포셉과 작은 지혈제를 사용하여 발과 숫자에서 모든 피부를 조심스럽게 제거하고 기본 연조직을 손상시키지 마십시오. 조직을 장착하려면 두 개의 유리 현미경 슬라이드 사이에 발을 개별적으로 놓고 거품 생검 패드를 양쪽 끝에서 접어 놓습니다. 두 개의 작은 바인더 클립을 사용하여 양쪽 끝에서 유리 슬라이드를 함께 압축합니다.
또는 풋 패드를 PBS의 1 내지 2 밀리리터와 함께 12 웰 플레이트로 복귀시킨다. 호일로 덮은 후 섭씨 네 도에 보관하여 최대 한 달 동안 형광을 유지하십시오. 이미징 시스템을 켜고, 수집 소프트웨어를 시작하고, 낮은 배율 또는 낮은 숫자 조리개 목표를 사용하여 이미지를 캡처합니다.
스테이지 활성화 대화 상자에서 예를 클릭합니다. 구성 탭에서 561나노미터 레이저를 활성화합니다. 메인 화면에서 보이는 버튼을 클릭하여 보이는 빔 경로를 활성화하십시오.
해당 활성 확인란을 클릭하여 감지기를 570 ~ 600 나노미터 범위로 설정하십시오. 획득 탭에서 타일 스캔 아이콘을 선택하고 원하는 해상도를 설정합니다. 현미경 단계에서 유리 슬라이드 사이에 압축 된 건조한 장착 조직 샘플을 배치하고 조직에 초점을 맞 춥니 다.
샘플의 한 모서리로 이동합니다. 타일 스캔 메뉴에서 마크 위치 버튼을 클릭하십시오. 반대쪽 모서리로 이동하여 스캔 경계를 설정하는 마크 위치 버튼을 다시 클릭하십시오.
Z 스택의 깊이를 설정하려면 라이브 버튼을 클릭하십시오. 샘플의 중앙으로 이동하고 z축 노브를 사용하여 샘플의 맨 아래로 스크롤합니다. Z-스택 메뉴 아래의 획득 탭에서 시작 버튼을 클릭합니다.
샘플 상단으로 스크롤하여 끝 버튼을 클릭하십시오. z-스텝 크기를 클릭하고 원하는 값으로 설정하십시오. 그런 다음 시작을 클릭하여 이미지 수집을 시작하십시오.
이 그림은 각 이미지의 오른쪽 하단에 FABER 점수가 기록 된 수술 후 일주일 후이 모델에서 기대할 수있는 조직 손실의 변화를 보여줍니다. 재건 현미경 검사 이미지는 수술 후 결찰 된 뒷다리의 발 패드에 대한 관류가 심각하게 감소한 것에 비해 비 결찰 된 대조군 발 패드에서 정상적인 혈관 해부학을 보여줍니다. 수술 20 일 후, 발 패드로의 관류는 비 결찰 된 조절의 정도까지는 아니지만 상당히 개선되었습니다.
비디오는 표면 렌더링이 애니메이션 기능을 사용하여 생성되었음을 보여줍니다. 관류 어셈블리에서 모든 기포를 내뿜습니다. 관류 중에 폐가 팽창하고 분홍색으로 변하면 바늘이 우심실에 침투하여 약간 수축해야합니다.
사지 조직은 근육 괴사, 조직 재생, 혈관 밀도 및 전구 세포 및 기타 조직 복구 세포의 모집을 평가하기 위해 면역 염색에 사용될 수 있습니다. 이 뮤린 괴저 모델에서 DiI 관류의 기술은 유전자 및 세포 요법의 연구에 사용되어 왔다. 이 연구는 중요한 사지 허혈 환자의 사지에서 관류를 개선하는 것을 목표로합니다.
