Este protocolo apresenta como criar um modelo de gangrena de pastilha de pé de rato usando administração de inibidor de massa e coagulação da artéria femoral. A perfusão diI permite, então, a visualização de alta resolução da vasculatura do bloco de pé. Este modelo é clinicamente relevante e pode ser usado para testes de drogas pré-clínicas e para estudar isquemia de membros.
A visualização de alta resolução da vasculatura oferece um meio tecnicamente fácil de avaliar a neovascularização. Este modelo de gangrena de almofada de pé tem aplicações importantes em pesquisas pré-clínicas de doença arterial periférica e isquemia crítica de membros. A perfusão dii é uma ferramenta útil para estudar a neovascularização em modelos animais.
Demonstrando o procedimento estarão Antoine Ribieras, residente cirúrgico, e Yulexi Ortiz, um pesquisador associado do meu laboratório. Primeiro, faça a solução de trabalho diI adicionando 200 microliters de solução de estoque DiI a 10 mililitros da solução diluente de trabalho imediatamente antes do uso. Aperte à mão para misturar bem.
Conecte duas ou três paradas de três vias e uma agulha borboleta calibre 25 em série. Prepare 10 seringas mililitros com quatro mililitros de PBS, 10 mililitros de solução DiI e 10 mililitros de formalina tamponada 10% neutra. Conecte a seringa com formalina à porta de entrada proximal e injete a solução para liberar o ar da linha.
Em seguida, vire a torneira para fechar o porto. Repita o mesmo procedimento, conectando as seringas com DiI e, em seguida, PBS aos portos de entrada média e dítal, respectivamente. Pós-eutanásia, coloque o animal em uma posição supina em uma almofada absorvente e proteja axilas e extremidades inferiores com agulhas.
Usando uma tesoura, faça uma incisão transversal para abrir a cavidade abdominal, depois exponha e divida o diafragma esquerdo e direito para acessar a cavidade torácica. Corte a parede do peito em ambos os lados do esterno das costelas inferiores para a primeira ou segunda costelas. Use um hemostat para pegar a extremidade inferior do esterno e refleti-lo em direção à cabeça do animal para expor a cavidade torácica.
Identifique o ventrículo esquerdo, que aparece de cor mais clara que o direito. Segure suavemente o coração com fórceps sem cortes e insira a agulha borboleta no ventrículo esquerdo. Use uma tesoura ou uma agulha calibre 18 para perfurar o átrio direito, permitindo que soluções de sangue e perfusão retornem ao coração para drenar.
Abra a porta da seringa com PBS e injete manualmente de dois a quatro mililitros a uma taxa de um a dois mililitros por minuto durante um a dois minutos para retirar o sangue do sistema vascular. Garanta a perfusão bem sucedida observando o sangramento do átrio direito. Após a injeção, feche a porta da seringa PBS.
Abra a porta da seringa com DiI e injete de cinco a dez mililitros a uma taxa de um a dois mililitros por minuto durante cinco minutos. Após a injeção, feche a porta da seringa DII e espere por dois minutos para permitir a incorporação do corante antes da injeção de fixação. Abra a porta da seringa com formalina e injete de cinco a dez mililitros a uma taxa de um a dois mililitros por minuto durante cinco minutos.
Após a injeção, remova a agulha do ventrículo esquerdo. Usando uma tesoura pesada, desloque a tíbia no tornozelo, separando completamente os pés esquerdo e direito das pernas inferiores. Coloque os pés colhidos em uma placa de 12 poços com um a dois mililitros de solução de 10%.
Enrole a placa com papel alumínio e armazene a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, substitua a solução fixativa em uma placa de 12 poços por um a dois mililitros de PBS por poço. Faça uma incisão longitudinal com um bisturi na parte plantar e dorsal do pé.
Em seguida, usando fórceps dentados e um pequeno hemostato, remova cuidadosamente toda a pele do pé e dos dígitos, não danificando os tecidos moles subjacentes. Para montar tecidos, coloque individualmente os pés entre dois slides de microscópio de vidro com uma almofada de biópsia de espuma dobrada sobre si mesma em cada extremidade. Use dois pequenos clipes de aglutinante para comprimir os slides de vidro juntos em cada extremidade.
Alternativamente, devolva a almofada para uma placa de 12 poços com um a dois mililitros de PBS. Depois de cobri-lo com papel alumínio, armazene-o a quatro graus Celsius para manter a fluorescência por até um mês. Ligue o sistema de imagem, inicie o software de aquisição e use uma baixa ampliação ou baixo objetivo de abertura numérica para capturar imagens.
Clique em sim para ativar a caixa de diálogo do estágio. Ative o laser de 561 nanômetros na guia de configuração. Na tela principal, ative um caminho visível do feixe clicando no botão visível.
Defina um detector para a faixa de 570 a 600 nanômetros clicando na caixa de seleção ativa correspondente. Selecione o ícone de digitalização de ladrilhos na guia de aquisição e defina a resolução desejada. Posicione a amostra de tecido montado seco compactada entre lâminas de vidro no estágio do microscópio e coloque o tecido em foco.
Navegue até um canto da amostra. No menu de varredura de ladrilhos, clique no botão de posição de marcação. Navegue até o canto oposto e clique no botão de posição de marca novamente definindo os limites de varredura.
Para definir a profundidade da pilha Z, clique no botão ao vivo. Navegue até o centro da amostra e use o botão do eixo z para rolar até a parte inferior da amostra. Na guia de aquisição no menu Z-stack, clique no botão iniciar.
Role até o topo da amostra e clique no botão final. Clique no tamanho do passo Z e defina para o valor desejado. Em seguida, clique em iniciar a aquisição de imagens.
A figura mostra a variação da perda de tecido que pode ser esperada a partir deste modelo uma semana após a cirurgia com escores FABER registrados no canto inferior direito de cada imagem. Imagens de microscopia de reconstrução revelam anatomia vascular normal em almofada de pé de controle não ligada em comparação com a perfusão severamente diminuída à almofada do pé de retrocesso ligado cinco dias após a cirurgia. 20 dias após a cirurgia, a perfusão ao pé melhorou significativamente, embora não na extensão do controle não ligado.
O vídeo mostra que a renderização de superfície foi então criada usando a funcionalidade de animação. Lave todas as bolhas de ar da montagem de perfusão. Se os pulmões se expandirem e ficarem rosados durante a perfusão, a agulha penetrou no ventrículo direito e deve ser retraída ligeiramente.
Os tecidos dos membros podem ser usados para imunossuagem para avaliar necrose muscular, regeneração tecidual, densidade dos vasos e recrutamento de células progenitoras, e outras células de reparação de tecidos. A técnica de perfusão dii neste modelo de gangrena murina tem sido usada em estudos de terapias genéticas e celulares. A pesquisa visa melhorar a perfusão em membros de pacientes com isquemia de membros críticos.
