פרוטוקול זה מציג כיצד ליצור מודל נמק כרית רגל עכבר באמצעות ניהול של מעכב מסה וקרישת עורק הירך. זלוף DiI מאפשר לאחר מכן הדמיה ברזולוציה גבוהה של כלי הדם כרית כף הרגל. מודל זה רלוונטי מבחינה קלינית וניתן להשתמש בו לבדיקות סמים פרה-קליניות ולחקר איסכמיה של איברים.
הדמיה ברזולוציה גבוהה של כלי דם מציעה אמצעי קל מבחינה טכנית להערכת ניאווסקולריזציה. זה מודל נמק כרית כף הרגל יש יישומים חשובים במחקר פרה קליני של מחלת עורקים היקפית ואיסכמיה גפיים קריטית. זלוף DiI הוא כלי שימושי לחקר ניאווסקולריזציה במודלים של בעלי חיים.
מדגימים את ההליך יהיו אנטואן Ribieras, של תושב כירורגי, ו Yulexi אורטיז, עמית מחקר מהמעבדה שלי. ראשית, הפוך פתרון עבודה DiI על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של פתרון מלאי DiI ל 10 מיליליטר של פתרון דילול עובד מיד לפני השימוש. לחץ ביד כדי לערבב היטב.
חבר שניים או שלושה עצירות משולשות ומחט פרפר 25 מד בסדרה. הכן מזרקים 10 מיליליטר עם ארבעה מיליליטר של PBS, 10 מיליליטר של פתרון DiI, ו 10 מיליליטר של 10% פורמלין חוצץ ניטרלי. חבר את המזרק עם פורמלין ליציאת הזרימה הפרוקסימלית והזריק את הפתרון כדי לשטוף את האוויר מהקו.
ואז להפוך את stopcock כדי לסגור את הנמל. חזור על אותו הליך, חיבור המזרקים באמצעות DiI ולאחר מכן PBS ליציאות הזרימה האמצעית והדיסטלית בהתאמה. לאחר המתת חסד, מניחים את החיה בתנוחה סופית על כרית סופגת ומאובטחים צירים וגפיים תחתונות עם מחטים.
באמצעות מספריים, לבצע חתך רוחבי כדי לפתוח את חלל הבטן, ולאחר מכן לחשוף ולחלק את הסרעפת השמאלית והימנית כדי לגשת לחלל בית החזה. חותכים את דופן החזה משני צדי עצם החזה מהצלעות התחתונות לצלע הראשונה או השנייה. השתמש hemostat כדי לתפוס את הקצה התחתון של עצם החזה ולשקף אותו לכיוון ראשו של החיה כדי לחשוף את חלל בית החזה.
זהה את החדר השמאלי, שנראה בהיר יותר בצבעו מאשר בצד ימין. לאחוז בעדינות את הלב עם מלקחיים קהים ולהכניס את מחט הפרפר לחדר השמאלי. השתמש במספריים או מחט 18 מד כדי לנקב את האטריום הנכון, ומאפשר פתרונות דם וזלוף לחזור ללב לנקז.
פתח את היציאה של המזרק עם PBS ולהזריק באופן ידני שניים עד ארבעה מיליליטר בקצב של 1 עד 2 מיליליטר לדקה במשך דקה עד שתי דקות כדי לשטוף את הדם ממערכת כלי הדם. להבטיח זלוף מוצלח על ידי התבוננות דימום מן האטריום הימני. לאחר ההזרקה, סגור את היציאה של מזרק PBS.
פתח את נמל המזרק עם DiI והזריק 5 עד 10 מיליליטר בקצב של 1 עד 2 מיליליטר לדקה למשך חמש דקות. לאחר ההזרקה, סגור את היציאה של מזרק DiI ולחכות שתי דקות כדי לאפשר שילוב של הצבע לפני הזרקה של קבוע. פתח את נמל המזרק עם פורמלין והזריק 5 עד 10 מיליליטר בקצב של 1 עד 2 מיליליטר לדקה במשך חמש דקות.
לאחר ההזרקה, להסיר את המחט מהחדר השמאלי. באמצעות מספריים כבדים, לפרוק את השוקה בקרסול, הפרדה מוחלטת את הרגליים השמאלית והימנית מן הרגליים התחתונות. מניחים רגליים שנקטפו בצלחת 12 היטב עם 1 עד 2 מיליליטר של תמיסת 10% פורמלין.
עוטפים את הצלחת בנייר כסף ומאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, להחליף את הפתרון הקבע בצלחת 12 היטב עם אחד עד שני מיליליטר של PBS לכל באר. בצע חתך אורך עם אזמל על חלק plantar וגב של כף הרגל.
לאחר מכן באמצעות מלקחיים שיניים ומוסטטי קטן, להסיר בזהירות את כל העור מכף הרגל והספרות, לא לפגוע ברקמות הרכות הבסיסיות. כדי להרכיב רקמות, מניחים בנפרד את הרגליים בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם כרית ביופסיה קצף מקופלת על עצמה בכל קצה. השתמש בשני מהדקי קלסר קטנים כדי לדחוס את שקופיות הזכוכית יחד בכל קצה.
לחלופין, להחזיר את כרית כף הרגל לצלחת 12 היטב עם אחד עד שני מיליליטר של PBS. לאחר כיסויו בנייר כסף, לאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס כדי לשמור על פלואורסצנטיות עד חודש אחד. הפעל את מערכת ההדמיה, הפעל את תוכנת הרכישה והשתמש במטרה הגדלה נמוכה או צמצם מספרי נמוך כדי ללכוד תמונות.
לחץ על כן לתיבת הדו-שיח של שלב ההפעלה. הפעל את לייזר 561 ננומטר בכרטיסיית התצורה. במסך הראשי, הפעל נתיב קרן נראה לעין על-ידי לחיצה על הכפתור הנראה לעין.
הגדר גלאי לטווח של 570 עד 600 ננומטר על-ידי לחיצה על תיבת הסימון הפעילה המתאימה. בחר את סמל סריקת האריחים בכרטיסיית הרכישה והגדר את הרזולוציה הרצויה. מקם דגימת רקמה רכובה יבשה דחוסה בין שקופיות זכוכית על במת המיקרוסקופ ולהביא רקמות לפוקוס.
נווט לפינה אחת של המדגם. תחת תפריט סריקת אריחים, לחץ על לחצן מיקום הסימון. נווט לפינה הנגדית ולחץ על לחצן מיקום הסימון שוב והגדר את גבולות הסריקה.
כדי להגדיר את עומק מחסנית Z, לחץ על לחצן חי. נווט למרכז המדגם והשתמש בידית ציר z כדי לגלול לתחתית המדגם. בכרטיסיית הרכישה תחת תפריט Z-stack, לחץ על לחצן התחל.
גלול לראש המדגם ולחץ על כפתור הקצה. לחץ על גודל שלב z והגדר לערך הרצוי. לאחר מכן לחץ על התחל להתחיל לרכוש תמונה.
הנתון מציג את השונות באובדן רקמות שניתן לצפות ממודל זה שבוע לאחר הניתוח עם ציוני FABER שנרשמו בפינה הימנית התחתונה של כל תמונה. תמונות מיקרוסקופיה של שחזור חושפות אנטומיה תקינה של כלי הדם במשטח כף הרגל הלא קשור בהשוואה לזלוף מופחת קשות לרפידת כף הרגל של אחוריים קשורים חמישה ימים לאחר הניתוח. 20 ימים לאחר הניתוח, זלוף לרפידת כף הרגל השתפר באופן משמעותי, אם כי לא במידה של שליטה לא קשורה.
הווידאו מראה כי עיבוד פני השטח נוצר לאחר מכן באמצעות פונקציונליות ההנפשה. יש לשטוף את כל בועות האוויר ממכלול הזלוף. אם הריאות מתרחבות והופכות ורודות במהלך הזלוף, המחט חדרה לחדר הימני ויש לסגת ממנה מעט.
רקמות גפיים יכולות לשמש לחיסון להערכת נמק שרירים, התחדשות רקמות, צפיפות כלי שיט וגיוס של תאי אב ותאי תיקון רקמות אחרים. הטכניקה של זלוף DiI במודל נמק מורין זה שימש במחקרים של טיפולים גנטיים ותאיים. מטרת המחקר היא לשפר את הזלוף בגפיים של חולים עם איסכמיה גפיים קריטית.
