Bu protokol, kitle inhibitörü ve femoral arter pıhtılaşmasının uygulanmasını kullanarak bir fare ayak yastığı kangren modelinin nasıl oluşturulacağını sunmaktadır. DiI perfüzyonu daha sonra ayak pedi vaskülatürünün yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesine izin verir. Bu model klinik olarak önemlidir ve klinik öncesi ilaç testi ve ekstremite iskemisini incelemek için kullanılabilir.
Vaskülatürün yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi, neovaskülarizasyonu değerlendirmek için teknik olarak kolay bir araç sunar. Bu ayak yastığı kangren modeli, periferik arter hastalığı ve kritik ekstremite iskemisinin klinik öncesi araştırmalarında önemli uygulamalara sahiptir. DiI perfüzyonu, hayvan modellerinde neovaskülarizasyonu incelemek için yararlı bir araçtır.
Prosedürü gösteren, cerrahi asistandan Antoine Ribieras ve laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Yulexi Ortiz olacak. İlk olarak, kullanımdan hemen önce 10 mililitre çalışan seyreltici çözeltiye 200 mikrolitre DiI stok çözeltisi ekleyerek DiI çalışma çözeltisi yapın. İyice karıştırmak için elinizle sallayın.
İki veya üç adet üç yönlü stopcock ve 25 gauge kelebek iğnesini seri olarak bağlayın. Dört mililitre PBS, 10 mililitre DiI çözeltisi ve 10 mililitre% 10 nötr tamponlu formalin içeren 10 mililitre şırıngalar hazırlayın. Şırıngayı formalin ile proksimal giriş portuna bağlayın ve havayı hattan temizlemek için çözeltiyi enjekte edin.
Ardından bağlantı noktasını kapatmak için stopcock'u çevirin. Şırıngaları DiI ve ardından PBS ile sırasıyla orta ve distal giriş portlarına bağlayarak aynı prosedürü tekrarlayın. Ötanazi sonrası, hayvanı emici bir ped üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve aksillaları ve alt ekstremiteleri iğnelerle sabitleyin.
Makas kullanarak, karın boşluğunu açmak için enine bir kesi yapın, ardından göğüs boşluğuna erişmek için sol ve sağ diyaframı açığa çıkarın ve bölün. Sternumun her iki tarafındaki göğüs duvarını alt kaburgalardan birinci veya ikinci kaburgalara kadar kesin. Sternumun alt ucunu tutmak için bir hemostat kullanın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için hayvanın kafasına doğru yansıtın.
Sağdan daha açık renkli görünen sol ventrikülü tanımlayın. Künt forseps ile kalbi yavaşça kavrayın ve kelebek iğnesini sol ventriküle yerleştirin. Doğru atriyumu delmek için makas veya 18 gauge iğne kullanın, böylece kan ve perfüzyon çözeltilerinin boşalması için kalbe geri dönmesine izin verin.
Şırınganın portunu PBS ile açın ve vasküler sistemden kanı temizlemek için bir ila iki dakika boyunca dakikada bir ila iki mililitre hızında iki ila dört mililitreyi manuel olarak enjekte edin. Sağ atriyumdan kanamayı gözlemleyerek başarılı perfüzyon sağlayın. Enjeksiyondan sonra, PBS şırıngasının portunu kapatın.
Şırınganın portunu DiI ile açın ve beş dakika boyunca dakikada bir ila iki mililitre oranında beş ila 10 mililitre enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, DiI şırıngasının portunu kapatın ve fiksatif enjeksiyonundan önce boyanın dahil edilmesine izin vermek için iki dakika bekleyin. Şırınganın portunu formalin ile açın ve beş dakika boyunca dakikada bir ila iki mililitre oranında beş ila 10 mililitre enjekte edin.
Enjeksiyondan sonra, iğneyi sol ventrikülden çıkarın. Ağır makas kullanarak, ayak bileğindeki tibianı yerinden çıkarın, sol ve sağ ayakları alt bacaklardan tamamen ayırın. Hasat edilen ayakları bir ila iki mililitre% 10 formalin çözeltisi içeren 12 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin.
Tabağı folyo ile sarın ve gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, fiksatif çözeltiyi 12 kuyucuklu bir plakada kuyu başına bir ila iki mililitre PBS ile değiştirin. Ayağın plantar ve dorsal kısmında bir neşter ile uzunlamasına bir kesi yapın.
Daha sonra dişli forseps ve küçük bir hemostat kullanarak, altta yatan yumuşak dokulara zarar vermeden, tüm cildi ayaktan ve basamaklardan dikkatlice çıkarın. Dokuları monte etmek için, ayakları her iki ucunda kendi üzerine katlanmış bir köpük biyopsi pedi ile iki cam mikroskop slaytı arasına ayrı ayrı yerleştirin. Cam slaytları her iki ucunda birbirine sıkıştırmak için iki küçük bağlayıcı klips kullanın.
Alternatif olarak, ayak yastığını bir ila iki mililitre PBS içeren 12 kuyucuklu bir plakaya geri koyun. Folyo ile kapladıktan sonra, floresanı bir aya kadar korumak için dört santigrat derecede saklayın. Görüntüleme sistemini açın, edinme yazılımını başlatın ve görüntüleri yakalamak için düşük büyütme veya düşük sayısal diyafram açıklığı hedefi kullanın.
Aşamayı etkinleştir iletişim kutusuna evet'i tıklatın. Yapılandırma sekmesinde 561 nanometre lazeri etkinleştirin. Ana ekranda, görünür düğmeye tıklayarak görünür bir ışın yolunu etkinleştirin.
İlgili etkin onay kutusuna tıklayarak 570 ila 600 nanometre aralığına bir dedektör ayarlayın. Edinme sekmesinde kutucuk tarama simgesini seçin ve istediğiniz çözünürlüğü ayarlayın. Mikroskop aşamasında cam slaytlar arasında sıkıştırılmış kuru monte edilmiş doku örneğini konumlandırın ve dokuyu odaklayın.
Örneğin bir köşesine gidin. Karo tarama menüsünün altında, konumu işaretle düğmesine tıklayın. Karşı köşeye gidin ve tarama sınırlarını ayarlayarak tekrar konum işaretle düğmesine tıklayın.
Z yığınının derinliğini ayarlamak için, canlı düğmesine tıklayın. Numunenin ortasına gidin ve numunenin en altına gitmek için z ekseni düğmesini kullanın. Z-stack menüsünün altındaki edinme sekmesinde, başlat düğmesine tıklayın.
Numunenin en üstüne ilerleyin ve bitiş düğmesine tıklayın. Z-adım boyutuna tıklayın ve istediğiniz değere ayarlayın. Ardından görüntü alımına başlamak için başlat'a tıklayın.
Şekil, ameliyattan bir hafta sonra bu modelden beklenebilecek doku kaybındaki varyasyonu, her görüntünün sağ alt köşesine kaydedilen FABER skorlarıyla göstermektedir. Rekonstrüksiyon mikroskopisi görüntüleri, ameliyattan beş gün sonra bağlı arka bacağın ayak pedine ciddi şekilde azalmış perfüzyon ile karşılaştırıldığında, bağlanmamış kontrol ayak pedinde normal vasküler anatomiyi ortaya koymaktadır. Ameliyattan 20 gün sonra, ayak yastığına perfüzyon, bağlanmamış kontrol ölçüsünde olmasa da, önemli ölçüde iyileşmiştir.
Videoda, yüzey işlemenin daha sonra animasyon işlevi kullanılarak oluşturulduğu gösterilmektedir. Perfüzyon tertibatındaki tüm hava kabarcıklarını yıkayın. Perfüzyon sırasında akciğerler genişler ve pembeye dönerse, iğne sağ ventriküle nüfuz etmiştir ve hafifçe geri çekilmelidir.
Ekstremite dokuları, kas nekrozunu, doku rejenerasyonunu, damar yoğunluğunu ve progenitör hücrelerin ve diğer doku onarım hücrelerinin işe alınmasını değerlendirmek için immün boyama için kullanılabilir. Bu murin kangren modelinde DiI perfüzyon tekniği, gen ve hücre tedavileri çalışmalarında kullanılmıştır. Araştırma, kritik ekstremite iskemisi olan hastaların ekstremitelerinde perfüzyonu iyileştirmeyi amaçlamaktadır.
