レーザーマイクロ解剖と質量分析の組み合わせにより、あらゆる種類の組織におけるプロテオミクスレベルでの空間的に分解された変化の調査が可能になります。私たちの場合、ニューロメラニン顆粒。当社のプロトコルは、限られたサンプル材料に基づくプロテオミクス解析を可能にします。
これは通常、死後の脳組織を扱う際の大きな課題です。単一細胞を単離して、プロテオミクスレベルで健康状態と疾患状態を比較することができるためです。これにより、疾患メカニズムの理解が深まる可能性があります。
まず、組織膜スライドをロボステージのスライドホルダーに配置し、組織を上に向けて配置します。組織切片の概要スキャンを取得する。スキャン機能を使用して、左上隅と右下隅から関心のある領域を選択します。
次に、[すべてのROIをスキャン]を選択してスキャンを実行します。現在の視野におけるニューロメラニン顆粒の自動選択のため。視野分析を選択します。
次に、「結果を反転」を選択し、RGB チャンネルのしきい値を設定します。そのため、プレビューウィンドウでニューロメラニン顆粒のみが赤で強調表示されます。次に、[OK]をクリックして、視野の調整された設定を使用します。
メンブレンで覆われたスライドの領域のみを使用してレーザー設定を調整します。サンプル採取チューブキャップに50マイクロリットルの超純水を入れます。そして、キャップをロボムーバーのコレクターに挿入します。
ソフトウェアインターフェイスを使用して、ロボムーバーをロボステージ2の上に配置して、サンプル収集を開始します。レーザーを開始します。レーザー加工中にエネルギーとフォーカスの設定を制御し、必要に応じて設定を調整します。
少なくとも最初の10個の物体について、孤立した物体をサンプル収集チューブキャップに適切に分離およびカタパルトするようにしてください。サンプリングが完了したら、ロボムーバーを開始位置に移動し、サンプル収集チューブを取り外します。遠心分離により試料を紡糸した後。
サンプルを真空濃縮器で1.5時間乾燥させます。本文に記載されているように三重消化を行った後。200〜400ナノグラムのサンプルペプチドを規定容量の0.1%TFAに溶解して、HPLC-MS分析用のサンプルを調製します。
不活性質量分析ガラスバイアルインレット中。濃度測定は試料量が少ないため適用できない場合。全イオン電流を比較して、同一のサンプル負荷を確認します。
プロテオミクス生データ解析を開始します。rawファイルをソフトウェアにロードするためのロードをクリックします。[実験の設定] をクリックして、サンプル名を割り当てます。
グループ固有のパラメーターを定義します。可変修飾として脱アミド化NQ、酸化M、およびカルバミドメチル化N項を選択して修飾を追加します。次いで、固定修飾としてカルバミドメチル化Cを添加する。
消化タブで消化酵素としてトリプシンを選択してください。ラベルフリー定量タブで、オプションLFQを追加し、10個を超えるファイルを処理する場合は、高速LFQオプションを選択して処理時間を短縮します。他のすべてのグループ固有のパラメータが工場出荷時の設定のままであることを確認します。
グローバル パラメーター タブに進み、uniprot から派生した FASTA ファイルを追加します。[シーケンス] タブの org をクリックします。識別子ルールを適宜変更します。
そして、ホモサピエンスの分類ID9606を追加します。タンパク質の定量には、独自のペプチドとかみそりのペプチドを選択してください。次に、ラベルフリー定量タブにタンパク質定量の尺度としてiBAQオプションを追加します。
他のすべてのグローバルパラメータが工場出荷時の設定のままであることを確認し、[開始]をクリックします。分析が正常に実行されたら、タンパク質グループを取得します。TXT 出力。
タンパク質グループをロードします。TXTファイルを解析ソフトウェアに格納します。iBAQ 値をメイン列として追加し、他のすべての列をタイプに従って並べ替えます。
カテゴリ列に基づいて行をフィルター処理し、有効な値に基づいて結果をフィルター処理することで、おとりと汚染物質をフィルター処理します。さらに処理するために、出力をtxt形式でエクスポートします。そして、研究課題に関する結果を評価します。
本研究では、NMGで1, 898のタンパク質群が同定され、周囲のSN組織で1, 565が同定され、そのうち1, 384が両方の組織領域で同定された。したがって、514および181のタンパク質群は、それぞれNMGおよびSN組織において排他的に同定された。代表的なDDA測定である。
SNと比較してNMGのiBAQ値がわずかに高いことは、NMGのタンパク質細胞質ダイニエン-1、重鎖1の存在量が高いことを示しました。この観察結果は、ペプチドESPEVLLTLDILKのPRM実験で検証することができました。NMGのより高い存在量が検出された。
MS1およびMS2レベルのピーク面積に基づきます。最も重要なステップは、プロトコルの残りの部分が適切に実行されるこのステップに基づいているため、NMGの分離です。LMD手順の後、サンプルは、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、またはリピドミクスなどのあらゆる種類のオミクス技術のために利用およびさらなるプロセスに利用することができる。
