したがって、このプロトコルを使用して、標準的な光学顕微鏡で胚全体にわたって固定マウス組織中のサイトネムを視覚化することができます。この技術を使用すると、蛍光タグ付きタンパク質を使用する遺伝子操作されたマウスモデルに依存するのではなく、サイトネムに沿って移動する内因性シグナル伝達タンパク質をプローブできます。このプロトコールを試みている間、サイトネムの最適な保存のために組織切片を穏やかに扱うことが重要です。
この手順を実演するのは、私のグループの主任研究者であるミリアム・ディラードと、セント・ジュードの大学院生であるクリスティーナ・デイリーです。まず、解剖ハサミと鉗子を使用して腹腔にY切開を行います。E 9.5胚を含む子宮を切除する。
完全なDMEM増殖培地中で胚を解剖する。鉗子を使用して、卵黄SAC、胎盤、および周囲の膜を除去します。HBSSで単離された胚をすすぎ、残存する羊膜組織および血液を除去する。
次に、パラホルムアルデヒドを作用濃度4%のパラホルムアルデヒドでHBSSに添加して固定液を調製する。この溶液を1ミリリットルの24ウェルプレートの各ウェルに加える。胚を個々の井戸に入れます。
ロッカーの上で穏やかな攪拌で胚を45分間孵化させる。インキュベーション後、固定液を取り出し、カルシウム、マグネシウム、および0.1%Tritonを添加したPBS中で30分間、胚を3回洗浄する。その後、ブロッキング溶液中で胚を穏やかな攪拌で2回、それぞれ1時間インキュベートする。
2回目のインキュベーション後、新鮮なブロッキング溶液を用いて胚をすすいでください。その間、補充されたPBSで抗体を希釈して一次抗体溶液を調製する。すすぎが完了したら、ブロッキング溶液を除去し、各ウェルに1ミリリットルの一次抗体溶液を加えます。
プレートを摂氏4度で3日間穏やかな回転でインキュベートします。一次抗体インキュベーションに続いて、補充されたPBSで胚を20RPMのロッカー上で1時間5回洗浄する。次いで、各ウェルに1ミリリットルの二次抗体溶液を加える。
暗闇の中で4°Cで穏やかに揺れながらプレートを3日間インキュベートします。二次抗体溶液を除去し、補充されたPBS中で30分間胚を3回洗浄する。低融点アガロースの4重量%溶液をカルシウムおよびマグネシウムと共にPBS中に調製する。
同時に、12ウェルプレートを摂氏55度のビーズバスに入れ、各ウェルに3ミリリットルのアガロースを加える。次に、プレートをベンチトップに置き、穴あきスプーンを使用して胚を個々のウェルに移します。ピペットチップを使用して、胚を溶液の中心になるように静かに埋め込み、方向付けします。
胚の向きが決まったら、プレートをマイナス20°Cで10分間置き、固化させます。次に、メスを使用して、井戸からアガロースブロック全体を取り除きます。胚の周りに長方形のブロックをカットし、両側に約0.3センチメートルのブロックを残します。
胚の尾端に沿ってブロックの余分な長さを残します。ビブラトームに胚をマウントするには、まずテープのストリップを標本ホルダーに塗布します。胚をブロックの上部の直立位置に向け、アガロースブロックをテープにスーパー接着して、ブレードが前後配列に軸方向のセクションを生成するようにします。
次に、ビブラトームチャンバーを冷たいHBSSで満たしてサンプルを完全に浸漬し、チャンバーを氷で囲みます。ビブラトームにパラメータを設定し、胚の連続軸方向切片化を行う。鉗子を使用して、個々のセクションをHBSSで満たされた別の皿に移します。
組織の損傷やサイトネムの破壊を避けるために、アガロースだけを保持するために鉗子を使用することを忘れないでください。F-アクチン染色を行うには、HBSSを除去し、補充PBS中のActinRedおよびDAPI溶液と共に切片を40分間インキュベートする。インキュベーション後、切片を補充PBS中で20分間3回洗浄する。
疎水性マーカーペンを使用して、荷電顕微鏡スライドの端の周りに障壁を描き、充填領域に少量のHBSSを追加します。次に、鉗子を使用してセクションをスライドに移動させます。鉗子を使用して余分なアガロースを除去します。
すべてのセクションがスライドに移されたら、ピペッティングと吸収タオルの角を使用して余分な液体を取り除きます。次に、スライドに数滴の取り付け媒体を追加します。カバースリップをスライドの上にそっと置いて取り付けます。
解析のために、共焦点顕微鏡または任意の高解像度顕微鏡で、遺伝子型ごとに最低3つの胚の組織切片のイメージングを行う。このプロトコルを使用して作成された正しい方向のセクションがここに示されています。ビブラトーム切片化と比較して、組織のクライオスタット切片化は細胞伸長を保存しなかった。
いくつかのGFP陽性膜断片が脊索と神経管の細胞間、およびクライオスタット切片中の隣接する神経管細胞間において検出された。しかしながら、神経管を取り囲む間葉系細胞における細胞伸長のF-アクチン染色は、クライオスタット切片において損なわれていた。ビブラトーム切片化は、胚全体および個々の組織切片の最小限の破壊を確実にした。
最適に処理された切片は、隣接する局在する床板神経上皮細胞と間葉系細胞との間のクチオネムの検出を可能にした。折り畳まれたまたは座屈した切片は、脊索と神経管の腹側床板との間の大きな分離によって明らかであった。上皮細胞間を移動する細胞膜伸長の喪失とを含む。
F-アクチンおよびDAPI染色切片は、神経管および脊索を囲む間葉系細胞およびクチオネムの一貫した間隔を有していた。切片のわずかな歪みがアクチンベースの伸長の断片化を引き起こし、細胞間に大きな隙間が形成され、繊細な取り扱いの必要性を強調している可能性がある。胚切片化後、組織切片の曲げや折り曲げを最小限に抑えることが不可欠です。
サイトネムの破壊を防ぐために。この技術を用いることで、モルフォゲンのようなシグナル伝達分子が組織全体にどのように広がっているかを直接可視化することができます。これは、組織や臓器がどのようにパターン化されているかについての新しい洞察を与えています。
