このプロトコルは、CRISPRを使用したマウス胎盤の時間特異的な標的操作を可能にするため、重要です。これにより、妊娠中期から後期の特定の遺伝子機能を解明することができます。マウス胎盤内で過剰発現を引き起こす遺伝子操作は非常にまれです。
この技術の主な利点は、胎盤内のさまざまな遺伝子発現の変化を可能にすることです。予備的な用語にこのテクニックがあっても落胆しないでください。このテクニックは難しいので、習得するには練習するのにかなりの時間が必要です。
はじめに、麻酔をかけたダムをノーズコーンで仰臥位に配置し、準備エリアに麻酔を維持します。ダムの腹部を徹底的に剃ります。角膜の乾燥を防ぐために、ダムの両目に人工涙液ジェルを置きます。
次に、滅菌綿の先端のアプリケーターを使用して、少なくとも3ラウンドのポビドンヨード溶液で手術部位を交互に消毒し、続いて70%エタノールとポビドンヨード溶液の最終コートを行います。準備が終わったら、麻酔ノーズコーン付きのダムを指定された手術部位に移動します。子宮開腹術の場合は、ダム仰臥位を手術台に置き、ノーズコーンをテープで所定の位置に固定します。
摂氏45度に設定された吸収パッドの下に加熱パッドを置きます。足指挟み逆流のなさで麻酔深度を確認後、鉗子とハサミでテント張りの皮膚から約2センチの正中線を切開します。次に、子宮角からそっとテントを張った滅菌鉗子を使用して腹膜を垂直に切開します。
腹部の両側を指で押して両方の子宮角をマッサージしてガイドします。露出した子宮を下腹部の上に置いた滅菌外科用ドレープの上に置き、必要に応じて温かい滅菌生理食塩水滴で湿らせます。子宮が露出したら、操作のために3対の胎盤を選択します。
胎盤操作の位置と子宮角内の胚の組織を記録します。コントロールプラスミドの胎盤注射のために、較正されたマイクロピペットを使用して3回の注射に十分な量の適切なコントロールプラスミドをロードします。脱落膜と接合部の間のすべての注射を、胎盤への横方向に約0.5ミリメートルの深さで実行します。
注射後、エレクトロポレーションの直前に、接触場所を滅菌生理食塩水でコーティングし、生理食塩水を子宮壁の3つの部位とパドルにスポイトまたはシリンジで正確に塗布します。注入後2分以内に、エレクトロポレーションマシンに取り付けられた3ミリメートルパドルのペアを使用してエレクトロポレーションを行います。CRISPRの取り込み効率と胚の生存率を確保するには、設定を30ボルト、30ミリ秒パルス、2パルス、970ミリ秒パルスオフ、ユニポーラに調整します。
エレクトロポレーションパドルを胎盤の外側の子宮壁にそっと押します。アノードパドルを注入部位の上に置き、カソードを真向かいに置きます。エレクトロポレーションマシンのパルスを押し、2つのパルスが完了するのを待ってから、エレクトロポレーションパドルを取り外します。
次に、前に示したように実験プラスミドの胎盤注射に進みます。対照群に対して行われたように、注射から2分以内に3つの実験的注射された胎盤すべてのエレクトロポレーションを実行します。胎盤操作が完了したら、指だけで子宮角を直接操作しながら、腹腔内の子宮角を優しくマッサージします。
長さ45センチメートルのコーティングおよび編組溶解可能な縫合糸を使用して、13ミリメートル、8分の3の円針合金を使用して腹膜層に中断縫合糸を実行します。腹膜層を縫合した後、腹膜に使用されるのと同じタイプの溶解性縫合糸を使用して、溶解可能な縫合糸で皮膚を縫合します。縫合が完了したら、皮膚の縫合糸に組織接着剤を塗布します。
組織接着剤が乾いたら、気化器の電源を切り、ダムを手術エリアから背中の支持ケージに移します。胎盤には、一般的なCRISPR Cas9コントロールプラスミドおよび活性化コントロールCRISPRプラスミドまたはIGF-1 SAM活性化プラスミドを注入した。代表的な剖検後の画像は、どの治療群においても表現型の外観に顕著な損傷または変化を示さなかった。
操作された同腹仔の未処理の胚の生存率は平均79.05%に減少しましたが、操作された胚の生存率は平均55.56%に有意に減少しましたが、どのグループの胎盤重量にも有意差はありませんでした。偽手術と比較して、手術直後の母親の体重増加に有意差はなかった。多くの妊娠中のダムは、おそらく手術中および手術後の短時間の摂食障害が原因で、手術の翌日に体重がわずかに減少または変化しなかった。
ほとんどのダムはE14.5で重量の増加を示しましたが、時折重量の減少が観察されました。qPCRは、対照胎盤と比較してIGF-1過剰発現胎盤におけるIGF-1発現の有意な増加を示した。E14.5胎盤のELIZA評価では、IGF-1過剰発現胎盤のIGF-1タンパク質レベルが対照胎盤と比較して有意に増加したことが示されました。
緑色の自家蛍光は、IGF-1過剰発現胎盤のみで赤色Cas9標識を伴う胎盤母体胎児界面のサブ領域を示し、胎盤の3つのサブ領域すべてでCRISPRの取り込みが成功したことを示しています。C2ハイブリダイゼーション標識における蛍光は、未処理の胎盤への移行を伴わずにIGF-1活性化プラスミドの取り込みを確認した。Prl8a8染色でマークされた赤い接合ゾーンの周囲にある脱落膜ゾーンと迷路ゾーンを特定できました。
胎盤と対応する胚の操作の種類と位置を記録することを忘れないでください。子宮角内の子宮頸部と胚の位置を記録することを強くお勧めします。この手順に続いて、胎盤、胚、およびダムの分析を行うことができます。
これにより、妊娠、胎盤機能、および胚発生における胎盤特異的な役割の遺伝子をより深く理解することができます。
