A estimativa de um nível de cálcio pré-sináptico é uma tarefa fundamental no estudo da transmissão sináptica. Estudar a sinalização de cálcio também é importante para encontrar maneiras de tratar doenças neurodegenerativas. A principal vantagem da técnica de carregamento apresentada é que a coloração tem sido realizada apenas para as células de interesse.
Nosso método de registro de intransiência de cálcio fornece uma resolução espacial-temporal extremamente boa. O método de registro apresentado pode ser útil para neurofisiologistas que precisam registrar processos periódicos rápidos usando um microscópio confocal. O passo mais difícil na técnica de carregamento é segurar o nervo dentro da pipeta.
O diâmetro da pipeta deve estar perfeitamente apto, por isso faça alguns vários. Conhecer todos os passos do protocolo são complicados e demonstrar que cada um deles vai ajudar muito. Comece fixando o tecido muscular levator auris longus de uma forma ligeiramente esticada na placa de Petri revestida de elastômero com os pinos finos de aço inoxidável e adicione a solução de Ringer ao prato até que o músculo esteja totalmente coberto.
Em seguida, use um puxador de micropipette para preparar uma micropipette com uma ponta afiada fina para as gravações intracelulares. Use capilares sem filamentos internos. Depois de marcar o afunilador com um abrasivo, quebre a ponta da micropipette, deixando uma ponta aberta para cerca de 100 micrômetros de diâmetro.
Em seguida, o fogo polir a ponta até que o diâmetro interno diminua de 80 micrômetros para 12 micrômetros. Quando feito, conecte um tubo de silicone a um lado e uma seringa sem agulha ao outro lado da pipeta de enchimento. Sob um microscópio estéreo, descubra onde o tronco nervoso se transforma em galhos nervosos separados.
Coloque a pipeta de enchimento na placa de Petri usando cera e, em seguida, mova a ponta da pipeta até que ela fique acima do nervo. Corte o nervo perto da fibra muscular com uma tesoura fina, deixando um pequeno pedaço do toco nervoso, cerca de um milímetro de comprimento. Em seguida, aspire o toco nervoso com alguma solução ringer na ponta da pipeta de enchimento, sem beliscar o nervo.
Uma vez feito, remova o tubo de silicone da pipeta de enchimento. Mais tarde, use uma seringa com um filamento longo para desenhar a solução de carregamento de corante. Em seguida, insira a ponta de filamento com a solução de carregamento na pipeta de enchimento e solte a mistura no toco nervoso, seguido de incubação da preparação do nervo à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.
Após a incubação, enxágue a preparação do nervo com a solução fresca de Ringer antes de tratá-lo com 50 mililitros da solução de Ringer em um copo de vidro a 25 graus Celsius por duas horas. Para a microscopia confocal, monte a preparação do nervo em uma câmara experimental revestida de elastômero de silício e fixe-a, ligeiramente esticada, com um conjunto de microaídas de aço. Em seguida, enxágue a preparação extensivamente com a solução do Ringer.
Instale um eletrodo de sucção na câmara. Depois de montar a câmara de preparação no estágio do microscópio, coloque as encaixes de entrada e saída na câmara. Ligue um sistema acionado pelo fluxo de gravidade para remover a solução em excesso da preparação.
Uma vez feito, conecte o eletrodo de sucção estimulante em um estimulador elétrico e garanta que as contrações musculares ocorram após estímulos. Em seguida, encha o sistema de perfusão com a solução do Ringer contendo 10 micromolar d-tubocurarine e ligue a bomba de sucção de perfusão para iniciar a perfusão. No microscópio confocal de varredura a laser, ou software LSCM, escolha o modo de eletrofisiologia e aquisição para definir parâmetros de imagem.
Nas configurações do menu de trabalho, selecione as configurações do gatilho para acionar o estimulador com o pulso de sincronização do microscópio e defina o gatilho no campo de quadros para o canal OUT 1. Gire o modo de digitalização para XYT em uma frequência de varredura de 1.400 hertz. O fator de zoom deve ser 6.1 com o pinhole totalmente aberto.
Certifique-se de que o modo X sequencial, transpassante e bidirecional esteja ligado, então, defina o tempo mínimo para formar um quadro a 52 milissegundos e colete quadros em um vídeo bruto a 20 quadros. Defina o comprimento de onda de excitação do laser de argônio a 488 nanômetros com 8% de potência de saída. Quando os parâmetros estiverem definidos, pressione o botão de modo ao vivo para obter uma visualização ao vivo dos terminais nervosos carregados com o corante.
No modo ao vivo, procure a região de interesse, ou ROI, para obter o melhor foco. Em seguida, mude o atraso no estimulador em dois milissegundos a menos em relação ao valor anterior e execute o software de aquisição de dados para adquirir 26 sequências, mudando cada sequência dois milissegundos do anterior. Para processar os vídeos capturados, execute o software Leica Application Suite X ou LAS X e abra o projeto criado.
Em seguida, clique em exportar e salvar como salvar quadros no formato TIF na pasta de destino. Em seguida, execute o software ImageJ e clique em arquivo, importação e sequência de imagem. Na janela de sequência de imagens abertas, escolha a pasta de destino e abra o primeiro quadro.
A partir das opções de sequência, vá para o campo de imagem inicial e defina o número do quadro para um para o primeiro quadro. Em seguida, no campo de incremento, defina o valor igual ao número de quadros na gravação inicial do sinal antes de clicar bem. Para salvar o arquivo gerado dos primeiros quadros costurados em uma pasta separada, clique nas guias arquivo, salvar e pastas em ordem.
Repita os procedimentos para 19 quadros definindo o número de quadro correspondente no campo de imagem inicial. Quando todas as imagens forem obtidas, clique em arquivo, importação e sequência de imagens para selecionar uma nos campos de imagem inicial e incremento. O vídeo final com todos os quadros costurados em resolução temporal aumentada pode ser visto.
Em seguida, salve o arquivo de vídeo no formato TIF. Para analisar o vídeo costurado, clique em imagem, pilhas, ferramentas e empilhador. Em seguida, vá para análise, ferramentas e gerente de ROI.
Arraste e solte o arquivo TIF salvo anteriormente na janela ImageJ e, em seguida, expanda a imagem para uma visualização melhor. Para melhorar a visualização da imagem, clique na imagem, ajuste, para ativar o contraste de brilho ao automático. Defina o fundo perto do terminal nervoso, desenhando ROI e agregando valor ao gerenciador de ROI.
Em seguida, calcule o plano de fundo clicando em mais e várias medidas. Copiar valores médios para colar no programa de planilha. Então, calcule o valor médio.
Em seguida, subtraia o valor médio calculado das pilhas clicando no processo, principal e subtraído. Digite o valor obtido e desenhe ROI em torno de um terminal nervoso através de uma linha de polígono antes de adicioná-lo ao gerenciador de ROI. Meça a intensidade transitória do terminal nervoso clicando em abas cada vez mais e multi medidas.
Em seguida, copie os valores médios de intensidade e cole-os ao programa de planilha para calcular a compensação média dos sinais. Divida os valores do sinal pelo valor médio de deslocamento. A partir do valor obtido, subtraia um e, em seguida, multiplicar-se por 100%, seguido de traçar um gráfico transitório de cálcio para determinar a amplitude.
Depois de carregar a preparação nervosa com um corante, a maior parte da sinapse está localizada perto do toco nervoso, indicando um nível suficiente de fluorescência. Após o processamento da imagem, foram obtidas transitoriedade de cálcio com a resolução espacial e temporal desejada. Um dos passos mais importantes deste protocolo é que o toco nervoso deve ser colocado na solução de corante contendo nos primeiros minutos após o corte do nervo.
Este método pode ser usado para carregar vários corantes e drogas em neurônios motores. O protocolo de registro pode ser útil para avaliar o cálcio em dendritos e colunas nas preparações do CNS. Nossa técnica permite registrar um sinal de cálcio com boa resolução espacial e temporal.
Estudar a transitoriedade do cálcio é uma ferramenta poderosa na regulação da pesquisa de uma liberação neurotransmissor e plasticidade sináptica.
