使用共聚焦显微镜以高时间分辨率记录小鼠神经肌肉接头中的钙瞬变

突触前钙水平的估计是研究突触传递的关键任务。研究钙信号传导对于寻找治疗神经退行性疾病的方法也很重要。所提出的上样技术的主要优点是仅对感兴趣的细胞进行染色。

我们记录钙不传递的方法提供了非常好的时空分辨率。所提出的配准方法对需要使用共聚焦显微镜记录快速周期性过程的神经生理学家有所帮助。加载技术中最困难的步骤是将神经固定在移液器内。

移液器的直径必须完全适合，因此请制作几个。了解协议中的所有步骤都很复杂，演示每个步骤都会有很大帮助。首先用细不锈钢销以略微拉伸的方式将长提肌组织固定在弹性体涂层的培养皿中，并将林格氏溶液添加到培养皿中，直到肌肉完全覆盖。

接下来，使用微量移液器拉拔器制备具有细尖尖端的微量移液器，用于细胞内记录。使用没有内部细丝的毛细管。用研磨剂划破锥度后，折断微量移液器吸头，使吸头的直径打开约100微米。

然后，用火抛光尖端，直到内径从 80 微米缩小到 12 微米。完成后，将硅胶管连接到一侧，将没有针头的注射器连接到进样移液器的另一侧。在体视显微镜下，找到神经干变成独立神经分支的位置。

使用蜡将填充移液器放在培养皿上，然后移动移液器尖端直到它站在神经上方。用细剪刀剪开靠近肌肉纤维的神经，留下一小块神经残端，长约一毫米。然后，用一些林格氏溶液将神经残端吸入填充移液器的尖端，不要挤压神经。

完成后，从进样移液器上取下硅胶管。之后，使用带有长丝的注射器抽取染料加载溶液。然后，将装有上样溶液的灯丝尖端插入灌装移液管中，并将混合物释放到神经残端上，然后在室温下在黑暗中孵育神经制剂30分钟。

孵育后，用新鲜的林格氏溶液冲洗神经制剂，然后在25摄氏度的玻璃烧杯中用50毫升林格氏溶液处理两小时。对于共聚焦显微镜，将神经制剂安装到硅弹性体涂层的实验室中，并用一组钢微针将其固定，稍微拉伸。然后，用林格氏溶液充分冲洗制剂。

在腔室上安装吸电极。将制备室安装到显微镜载物台上后，将入口和出口配件放入室中。打开重力流驱动系统，从制备中去除多余的溶液。

完成后，将刺激吸力电极插入电刺激器，并确保刺激后发生肌肉收缩。然后，用含有 10 微摩尔 d-tubocurine 的林格氏溶液填充灌注系统，并打开灌注抽吸泵开始灌注。在激光扫描共聚焦显微镜或LSCM软件中，选择电生理学和采集模式以设置成像参数。

在作业菜单设置中，选择触发设置以使用显微镜同步脉冲触发刺激器，并将帧场上的触发设置为OUT 1通道。将扫描模式以 1， 400 赫兹的扫描频率转为 XYT。变焦系数应为 6.1，针孔完全打开。

确保顺序、跨通道、双向 X 模式处于打开状态，然后将形成帧的最短时间设置为 52 毫秒，并在 20 帧处收集原始视频中的帧。将氩激光的激发波长设置为488纳米，输出功率为8%。设置参数后，按实时模式按钮可实时预览装有染料的神经末梢。

在实时模式下，搜索感兴趣区域或ROI以获得最佳焦点。然后，将刺激器上的延迟相对于前一个值少移动两毫秒，并运行数据采集软件，通过将每个序列从前一个序列偏移两毫秒来获取 26 个序列。要处理捕获的视频，请运行 Leica 应用程序套件 X 或 LAS X 软件，然后打开创建的项目。

然后，单击导出并另存为以将帧以TIF格式保存在目标文件夹中。接下来，运行 ImageJ 软件并单击文件、导入和图像序列。在打开的图像序列窗口中，选择目标文件夹并打开第一帧。

从序列选项中，转到起始图像字段并将第一帧的帧编号设置为 1。然后，在增量字段中，将值设置为等于初始信号记录中的帧数，然后单击确定。要将拼接的第一帧的生成文件保存在单独的文件夹中，请依次单击文件、保存和文件夹选项卡。

通过在起始图像字段中设置相应的帧编号，对 19 帧重复这些步骤。获取所有图像后，单击文件、导入和图像序列以在起始图像和增量字段中选择一个。可以看到最终的视频，所有帧以更高的时间分辨率拼接在一起。

然后，将视频文件保存为 TIF 格式。要分析拼接的视频，请单击图像、堆栈、工具和堆栈排序器。然后，转到分析、工具和投资回报率管理器。

将之前保存的 TIF 文件拖放到 ImageJ 窗口中，然后展开图像以获得更好的视图。要改善图像可视化，请单击图像，进行调整，将亮度对比度转换为自动。通过绘制ROI并为ROI管理器增加价值，将背景设置在靠近神经末梢的位置。

然后，通过单击更多和多度量来计算背景。复制平均值以粘贴到电子表格程序中。然后，计算平均值。

接下来，通过单击过程、主和减法从堆栈中减去计算的平均值。输入获得的值，并通过多边形线在神经末梢周围绘制ROI，然后将其添加到ROI管理器。通过单击更多和多测量选项卡来测量神经末梢的瞬态强度。

然后，复制平均强度值并将其粘贴到电子表格程序中以计算信号的平均偏移量。将信号值除以平均偏移值。从获得的值中，减去 1，然后乘以 100%，然后绘制钙瞬态图以确定振幅。

用染料加载神经制剂后，大部分突触位于神经残端附近，表明有足够的荧光水平。经过图像处理后，获得了具有所需空间和时间分辨率的钙瞬变。该方案中最重要的步骤之一是，必须在切割神经后的最初几分钟内将神经残端置于含有染料的溶液中。

该方法可用于将各种染料和药物加载到运动神经元中。注册方案可用于评估中枢神经系统制剂中树突和棘中的钙。我们的技术允许以良好的空间和时间分辨率记录钙信号。

研究钙瞬变是研究神经递质释放和突触可塑性调节的有力工具。