يعد تقدير مستوى الكالسيوم قبل المشبكي مهمة رئيسية في دراسة الانتقال المشبكي. دراسة إشارات الكالسيوم مهمة أيضا لإيجاد طرق لعلاج الأمراض العصبية التنكسية. الميزة الرئيسية لتقنية التحميل المقدمة هي أن التلطيخ قد تم إجراؤه فقط للخلايا ذات الاهتمام.
توفر طريقتنا لتسجيل تعنت الكالسيوم دقة مكانية وزمنية جيدة للغاية. يمكن أن تكون طريقة التسجيل المقدمة مفيدة لأخصائيي الفيزيولوجيا العصبية الذين يحتاجون إلى تسجيل عمليات دورية سريعة باستخدام المجهر البؤري. الخطوة الأكثر صعوبة في تقنية التحميل هي الإمساك بالعصب داخل الماصة.
يجب أن يكون قطر الماصة مناسبا تماما ، لذا اصنع عدة منها. معرفة جميع الخطوات في البروتوكول معقدة وإظهار كل واحد منهم سيساعد كثيرا. ابدأ بتثبيت الأنسجة العضلية الرافعة أوريس لونغوس بطريقة ممتدة قليلا في طبق بتري المطلي بالمطاط الصناعي مع دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ الدقيقة وأضف محلول رينجر إلى الطبق حتى يتم تغطية العضلات بالكامل.
بعد ذلك ، استخدم مجتذب الماصة الدقيقة لإعداد ماصة دقيقة مع طرف حاد دقيق للتسجيلات داخل الخلايا. استخدم الشعيرات الدموية بدون خيوط داخلية. بعد تسجيل المستدق باستخدام مادة كاشطة ، قم بقطع طرف الماصة الدقيقة ، تاركا الطرف مفتوحا لقطره حوالي 100 ميكرومتر.
ثم ، قم بتلميع الطرف حتى يتقلص القطر الداخلي من 80 ميكرومتر إلى 12 ميكرومتر. عند الانتهاء ، قم بتوصيل أنبوب سيليكون إلى جانب واحد ومحقنة بدون إبرة إلى الجانب الآخر من ماصة التعبئة. تحت المجهر الاستريو ، ابحث عن المكان الذي يتحول فيه جذع العصب إلى فروع عصبية منفصلة.
ضع ماصة الحشوة على طبق بتري باستخدام الشمع ثم حرك طرف الماصة حتى يقف فوق العصب. قطع العصب بالقرب من الألياف العضلية بمقص دقيق ، وترك قطعة صغيرة من الجذع العصبي ، يبلغ طولها حوالي ملليمتر واحد. ثم ، قم بشفط جذع العصب ببعض محلول رينجر في طرف ماصة الملء ، دون قرص العصب.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة أنبوب السيليكون من ماصة التعبئة. في وقت لاحق ، استخدم حقنة ذات خيوط طويلة لرسم محلول تحميل الصبغة. ثم أدخل طرف الخيوط مع محلول التحميل في ماصة الحشو وحرر الخليط على جذع العصب ، يليه احتضان المستحضر العصبي في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
بعد الحضانة ، اشطف المستحضر العصبي بمحلول رينجر الطازج قبل معالجته ب 50 ملليلتر من محلول رينجر في كوب زجاجي عند 25 درجة مئوية لمدة ساعتين. بالنسبة للمجهر البؤري ، قم بتركيب المستحضر العصبي في غرفة تجريبية مطلية بمطاط صناعي من السيليكون وقم بإصلاحه ، ممتدا قليلا ، مع مجموعة من الإبر الدقيقة الفولاذية. ثم ، شطف التحضير على نطاق واسع مع حل رينجر.
تثبيت قطب شفط على الغرفة. بعد تركيب غرفة التحضير على مرحلة المجهر ، ضع تركيبات المدخل والمخرج في الغرفة. قم بتشغيل نظام مدفوع بتدفق الجاذبية لإزالة المحلول الزائد من المستحضر.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتوصيل قطب الشفط المحفز بمحفز كهربائي وتأكد من حدوث تقلصات عضلية بعد المحفزات. بعد ذلك ، املأ نظام التروية بمحلول Ringer الذي يحتوي على 10 ميكرومولار d-tubocurarine وقم بتشغيل مضخة شفط التروية لبدء التروية. في المجهر البؤري المسح الضوئي بالليزر ، أو برنامج LSCM ، اختر الفيزيولوجيا الكهربية ووضع الاكتساب لتعيين معلمات التصوير.
في إعدادات قائمة المهام ، حدد إعدادات المشغل لتشغيل المحفز باستخدام نبضة مزامنة المجهر واضبط الزناد على حقل الإطار على قناة OUT 1. أدر وضع المسح الضوئي إلى XYT عند تردد المسح الضوئي البالغ 1400 هرتز. يجب أن يكون عامل التكبير/التصغير 6.1 مع فتح الثقب بالكامل.
تأكد من تشغيل وضع X المتسلسل والمحول ثنائي الاتجاه ، ثم قم بتعيين الحد الأدنى من الوقت لتشكيل إطار عند 52 مللي ثانية وجمع الإطارات في فيديو خام عند 20 إطارا. اضبط الطول الموجي للإثارة ليزر الأرجون على 488 نانومتر مع 8٪ من طاقة الإخراج. عند تعيين المعلمات، اضغط على زر الوضع المباشر للحصول على معاينة مباشرة للأطراف العصبية المحملة بالصبغة.
في الوضع المباشر، ابحث عن المنطقة محل الاهتمام، أو عائد الاستثمار، للحصول على أفضل تركيز. بعد ذلك ، قم بتحويل التأخير على المحفز بمقدار مللي ثانية أقل بالنسبة للقيمة السابقة وقم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات للحصول على 26 تسلسلا عن طريق تحويل كل تسلسل بمللي ثانية من التسلسل السابق. لمعالجة مقاطع الفيديو التي تم التقاطها، قم بتشغيل برنامج Leica Application Suite X، أو LAS X، وافتح المشروع الذي تم إنشاؤه.
ثم انقر فوق تصدير وحفظ لحفظ الإطارات بتنسيق TIF في المجلد الوجهة. بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج ImageJ وانقر فوق تسلسل الملفات والاستيراد والصور. في نافذة تسلسل الصور المفتوحة، اختر المجلد الوجهة وافتح الإطار الأول.
من خيارات التسلسل، انتقل إلى حقل صورة البدء واضبط رقم الإطار على واحد للإطار الأول. ثم، في حقل التزايد، قم بتعيين القيمة التي تساوي عدد الإطارات في تسجيل الإشارة الأولية قبل النقر فوق موافق. لحفظ الملف الذي تم إنشاؤه من الإطارات الأولى المخيطة في مجلد منفصل ، انقر فوق علامات تبويب الملف والحفظ والمجلد بالترتيب.
كرر الإجراءات الخاصة ب 19 إطارا عن طريق تعيين رقم الإطار المقابل في حقل صورة البداية. عند الحصول على جميع الصور ، انقر فوق تسلسل الملف والاستيراد والصورة لتحديد واحد في حقلي صورة البدء والتزايد. يمكن رؤية الفيديو النهائي مع جميع الإطارات المخيطة معا بدقة زمنية متزايدة.
ثم احفظ ملف الفيديو بتنسيق TIF. لتحليل الفيديو المخيط ، انقر فوق الصورة والمكدسات والأدوات وفارز المكدس. ثم انتقل إلى التحليل والأدوات ومدير عائد الاستثمار.
اسحب ملف TIF المحفوظ مسبقا وأفلته في نافذة ImageJ ثم قم بتوسيع الصورة للحصول على عرض أفضل. لتحسين تصور الصورة ، انقر فوق الصورة ، وضبطها ، لتحويل تباين السطوع إلى تلقائي. قم بتعيين الخلفية بالقرب من الطرف العصبي عن طريق رسم عائد الاستثمار وإضافة قيمة إلى مدير عائد الاستثمار.
ثم احسب الخلفية بالنقر فوق قياس أكثر ومتعدد. انسخ القيم المتوسطة للصقها في برنامج جدول البيانات. ثم احسب متوسط القيمة.
بعد ذلك ، اطرح متوسط القيمة المحسوبة من المكدسات بالنقر فوق العملية والرئيسية والطرح. أدخل القيمة التي تم الحصول عليها وارسم عائد الاستثمار حول محطة عصبية عبر خط مضلع قبل إضافته إلى مدير عائد الاستثمار. قم بقياس الشدة العابرة للطرف العصبي عن طريق النقر فوق علامات تبويب قياس أكثر ومتعددة.
بعد ذلك، انسخ قيم متوسط الكثافة والصقها في برنامج جدول البيانات لحساب متوسط إزاحة الإشارات. قسمة قيم الإشارة على متوسط قيمة الإزاحة. من القيمة التي تم الحصول عليها ، اطرح واحدا ثم اضرب بنسبة 100٪ متبوعا برسم رسم بياني عابر للكالسيوم لتحديد السعة.
بعد تحميل إعداد العصب بصبغة ، يقع معظم المشبك بالقرب من جذع العصب ، مما يشير إلى مستوى كاف من التألق. بعد معالجة الصور ، تم الحصول على عبور الكالسيوم مع الدقة المكانية والزمنية المطلوبة. واحدة من أهم الخطوات في هذا البروتوكول هي أنه يجب وضع جذع العصب في محلول يحتوي على صبغة في الدقائق القليلة الأولى بعد قطع العصب.
يمكن استخدام هذه الطريقة لتحميل مختلف الأصباغ والأدوية في الخلايا العصبية الحركية. يمكن أن يكون بروتوكول التسجيل مفيدا لتقييم الكالسيوم في التشعبات والعمود الفقري في مستحضرات الجهاز العصبي المركزي. تسمح تقنيتنا بتسجيل إشارة الكالسيوم بدقة مكانية وزمنية جيدة.
دراسة انتقال الكالسيوم هي أداة قوية في تنظيم البحوث لإطلاق الناقل العصبي واللدونة المتشابكة.
