La stima di un livello di calcio presinaptico è un compito chiave nello studio della trasmissione sinaptica. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative. Il principale vantaggio della tecnica di caricamento presentata è che la colorazione è stata eseguita solo per le celle di interesse.
Il nostro metodo per registrare l'intransienza del calcio fornisce un'ottima risoluzione spazio-temporale. Il metodo di registrazione presentato può essere utile ai neurofisiologi che hanno bisogno di registrare processi periodici veloci utilizzando un microscopio confocale. Il passo più difficile nella tecnica di caricamento è tenere il nervo all'interno della pipetta.
Il diametro della pipetta deve essere perfettamente adatto, quindi fatene diversi. Conoscere tutti i passaggi del protocollo sono complicati e dimostrare ciascuno di essi aiuterà molto. Iniziare fissando il tessuto muscolare dell'elevatore auris longus in modo leggermente allungato nella piastra di Petri rivestita di elastomero con i perni in acciaio inossidabile fine e aggiungere la soluzione di Ringer al piatto fino a quando il muscolo è completamente coperto.
Quindi, utilizzare un estrattore di micropipette per preparare una micropipetta con una punta affilata fine per le registrazioni intracellulari. Utilizzare capillari senza filamenti interni. Dopo aver inciso la conicità con un abrasivo, rompere la punta della micropipetta, lasciando una punta aperta a circa 100 micrometri di diametro.
Quindi, lucidare a fuoco la punta fino a quando il diametro interno si restringe da 80 micrometri a 12 micrometri. Al termine, collegare un tubo di silicone su un lato e una siringa senza ago sull'altro lato della pipetta di riempimento. Sotto un microscopio stereo, trova dove il tronco nervoso si trasforma in rami nervosi separati.
Posizionare la pipetta di riempimento sulla piastra di Petri con la cera, quindi spostare la punta della pipetta fino a quando non si trova sopra il nervo. Tagliare il nervo vicino alla fibra muscolare con forbici sottili, lasciando un piccolo pezzo del moncone nervoso, lungo circa un millimetro. Quindi, aspirare il moncone nervoso con una soluzione di Ringer nella punta della pipetta di riempimento, senza pizzicare il nervo.
Una volta fatto, rimuovere il tubo di silicone dalla pipetta di riempimento. Successivamente, utilizzare una siringa con un lungo filamento per disegnare la soluzione di caricamento del colorante. Quindi, inserire la punta del filamento con la soluzione di carico nella pipetta di riempimento e rilasciare la miscela sul moncone nervoso, quindi incubare la preparazione del nervo a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, sciacquare la preparazione nervosa con la soluzione fresca di Ringer prima di trattarla con 50 millilitri di soluzione di Ringer in un becher di vetro a 25 gradi Celsius per due ore. Per la microscopia confocale, montare la preparazione del nervo in una camera sperimentale rivestita di elastomero di silicio e fissarla, leggermente allungata, con una serie di microaghi in acciaio. Quindi, sciacquare abbondantemente la preparazione con la soluzione di Ringer.
Installare un elettrodo di aspirazione sulla camera. Dopo aver montato la camera di preparazione sul palco del microscopio, posizionare i raccordi di ingresso e uscita nella camera. Accendere un sistema azionato dal flusso a gravità per rimuovere la soluzione in eccesso dalla preparazione.
Una volta fatto, collegare l'elettrodo di aspirazione stimolante in uno stimolatore elettrico e assicurarsi che le contrazioni muscolari si verifichino dopo gli stimoli. Quindi, riempire il sistema di perfusione con la soluzione di Ringer contenente 10 micromolari d-tubocurarina e accendere la pompa di aspirazione della perfusione per avviare la perfusione. Nel microscopio confocale a scansione laser o nel software LSCM, scegliere l'elettrofisiologia e la modalità di acquisizione per impostare i parametri di imaging.
Nelle impostazioni del menu di lavoro, selezionare le impostazioni di trigger per attivare lo stimolatore con l'impulso di sincronizzazione del microscopio e impostare il trigger sul campo frame sul canale OUT 1. Ruotare la modalità di scansione su XYT con una frequenza di scansione di 1.400 hertz. Il fattore di zoom dovrebbe essere 6,1 con il foro stenopeico completamente aperto.
Assicurati che la modalità X sequenziale, traspassante e bidirezionale sia attivata, quindi imposta il tempo minimo per formare un fotogramma a 52 millisecondi e raccogli i fotogrammi in un video raw a 20 fotogrammi. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione del laser argon a 488 nanometri con l'8% della potenza di uscita. Quando i parametri sono impostati, premere il pulsante della modalità live per ottenere un'anteprima dal vivo delle terminazioni nervose caricate con il colorante.
In modalità live, cerca la regione di interesse, o ROI, per ottenere lo stato attivo migliore. Quindi, spostare il ritardo sullo stimolatore di due millisecondi in meno rispetto al valore precedente ed eseguire il software di acquisizione dati per acquisire 26 sequenze spostando ogni sequenza di due millisecondi dalla precedente. Per elaborare i video acquisiti, eseguite il software Leica Application Suite X o LAS X e aprite il progetto creato.
Quindi, fai clic su esporta e salva con nome per salvare i fotogrammi in formato TIF nella cartella di destinazione. Quindi, eseguire il software ImageJ e fare clic su file, importazione e sequenza di immagini. Nella finestra Apri sequenza di immagini, scegliete la cartella di destinazione e aprite il primo fotogramma.
Dalle opzioni della sequenza, vai al campo dell'immagine iniziale e imposta il numero di fotogramma su uno per il primo fotogramma. Quindi, nel campo incremento, impostare il valore uguale al numero di fotogrammi nella registrazione iniziale del segnale prima di fare clic su OK. Per salvare il file generato dei primi fotogrammi cuciti in una cartella separata, fare clic sulle schede file, salva e cartella nell'ordine indicato.
Ripetete le procedure per 19 fotogrammi impostando il numero di fotogramma corrispondente nel campo dell'immagine iniziale. Quando tutte le immagini sono ottenute, fare clic su file, importa e sequenza di immagini per selezionarne una nei campi immagine iniziale e incremento. Il video finale con tutti i fotogrammi uniti insieme a una maggiore risoluzione temporale può essere visto.
Quindi, salvare il file video in formato TIF. Per analizzare il video cucito, fai clic su immagine, pile, strumenti e ordinatore di pile. Quindi, vai a Analisi, strumenti e ROI Manager.
Trascinare e rilasciare il file TIF salvato in precedenza nella finestra ImageJ e quindi espandere l'immagine per una visualizzazione migliore. Per migliorare la visualizzazione dell'immagine, fare clic sull'immagine, regolare, per trasformare il contrasto di luminosità in automatico. Imposta lo sfondo vicino al terminale nervoso disegnando il ROI e aggiungendo valore al gestore del ROI.
Quindi, calcola lo sfondo facendo clic su più e multi misura. Copiare i valori medi da incollare nel programma del foglio di calcolo. Quindi, calcola il valore medio.
Quindi, sottrarre il valore medio calcolato dagli stack facendo clic su processo, principale e sottrai. Inserisci il valore ottenuto e disegna il ROI attorno a un terminale nervoso tramite una linea poligonale prima di aggiungerlo al gestore del ROI. Misurare l'intensità transitoria del terminale nervoso facendo clic su più schede e multi misura.
Quindi, copiare i valori di intensità media e incollarli nel programma del foglio di calcolo per calcolare l'offset medio dei segnali. Dividere i valori del segnale per il valore di offset medio. Dal valore ottenuto, sottrarne uno e quindi moltiplicare per 100% seguito dal grafico transiente del calcio per determinare l'ampiezza.
Dopo aver caricato la preparazione del nervo con un colorante, la maggior parte della sinapsi si trova vicino al moncone nervoso, indicato un livello sufficiente di fluorescenza. Dopo l'elaborazione delle immagini, è stata ottenuta la transitorietà del calcio con la risoluzione spaziale e temporale desiderata. Uno dei passaggi più importanti in questo protocollo è che il moncone nervoso deve essere inserito nella soluzione contenente colorante nei primi minuti dopo aver tagliato il nervo.
Questo metodo può essere utilizzato per caricare vari coloranti e farmaci nei motoneuroni. Il protocollo di registrazione può essere utile per valutare il calcio nei dendriti e nelle spine nei preparati del SNC. La nostra tecnica permette di registrare un segnale calcico con una buona risoluzione spaziale e temporale.
Lo studio della transitorietà del calcio è un potente strumento nella ricerca sulla regolazione del rilascio di un neurotrasmettitore e della plasticità sinaptica.
