Оценка пресинаптического уровня кальция является ключевой задачей в изучении синаптической передачи. Изучение передачи сигналов кальция также важно для поиска способов лечения нейродегенеративных заболеваний. Основным преимуществом представленной методики загрузки является то, что окрашивание выполнено только для интересующих клеток.
Наш метод регистрации непримиримости кальция обеспечивает чрезвычайно хорошее пространственно-временное разрешение. Представленный метод регистрации может быть полезен нейрофизиологам, которым необходимо регистрировать быстрые периодические процессы с помощью конфокального микроскопа. Самым сложным этапом в технике загрузки является удержание нерва внутри пипетки.
Диаметр пипетки должен идеально подходить, поэтому сделайте несколько. Знание всех шагов в протоколе сложны и демонстрация каждого из них очень поможет. Начните с фиксации мышечной ткани levator auris longus слегка растянутым образом в чашке Петри, покрытой эластомером, тонкими штифтами из нержавеющей стали и добавьте раствор Рингера в блюдо до тех пор, пока мышца не будет полностью покрыта.
Затем используйте съемник микропипетки, чтобы подготовить микропипетку с тонким острым наконечником для внутриклеточных записей. Используйте капилляры без внутренних нитей. Забив конус абразивом, отломите наконечник микропипетки, оставив наконечник открытым примерно до 100 микрометров в диаметре.
Затем отполируйте наконечник огнем до тех пор, пока внутренний диаметр не уменьшится с 80 микрометров до 12 микрометров. Когда все будет готово, прикрепите силиконовую трубку к одной стороне и шприц без иглы к другой стороне пломбировочной пипетки. Под стереомикроскопом найдите, где нервный ствол превращается в отдельные нервные ветви.
Поместите начиночную пипетку на чашку Петри с помощью воска, а затем переместите кончик пипетки, пока он не встанет над нервом. Разрежьте нерв близко к мышечному волокну тонкими ножницами, оставив небольшой кусочек культи нерва, длиной около одного миллиметра. Затем аспирируйте культю нерва каким-нибудь раствором Рингера в кончик пломбировочной пипетки, не защемляя нерв.
После этого снимите силиконовую трубку с пломбировочной пипетки. Позже используйте шприц с длинной нитью, чтобы нарисовать раствор для загрузки красителя. Затем вводят наконечник нити с загрузочным раствором в пломбировочную пипетку и выпускают смесь на культю нерва с последующим инкубированием нервного препарата при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.
После инкубации промыть нервный препарат свежим раствором Рингера, прежде чем обрабатывать его 50 миллилитрами раствора Рингера в стеклянном стакане при 25 градусах Цельсия в течение двух часов. Для конфокальной микроскопии установите нервный препарат в экспериментальную камеру, покрытую кремниевым эластомером, и зафиксируйте ее, слегка растянутую, с помощью набора стальных микроигл. Затем тщательно промойте препарат раствором Рингера.
Установите всасывающий электрод на камеру. После установки подготовительной камеры на ступень микроскопа поместите впускные и выпускные фитинги в камеру. Включите систему с гравитационным потоком, чтобы удалить лишний раствор из препарата.
После этого подключите стимулирующий всасывающий электрод к электрическому стимулятору и убедитесь, что мышечные сокращения происходят после стимулов. Затем заполните перфузионную систему раствором Рингера, содержащим 10 микромолярного d-тубокурарина, и включите перфузионный всасывающий насос, чтобы начать перфузию. В лазерном сканирующем конфокальном микроскопе или программном обеспечении LSCM выберите электрофизиологию и режим сбора для установки параметров визуализации.
В настройках меню заданий выберите настройки триггера для запуска стимулятора с синхронизирующим импульсом микроскопа и установите триггер на поле кадра на канал OUT 1. Включите режим сканирования в XYT на частоте сканирования 1,400 герц. Коэффициент масштабирования должен быть 6,1 при полностью открытом отверстии.
Убедитесь, что включен последовательный, транспассионный, двунаправленный режим X, затем установите минимальное время для формирования кадра в 52 миллисекунды и сбора кадров в необработанное видео через 20 кадров. Установите длину волны возбуждения аргонового лазера на уровне 488 нанометров при 8% выходной мощности. Когда параметры установлены, нажмите кнопку режима реального времени, чтобы получить предварительный просмотр нервных окончаний, загруженных красителем.
В режиме реального времени найдите интересующий регион или рентабельность инвестиций, чтобы получить наилучший фокус. Затем сдвиньте задержку на стимуляторе на две миллисекунды меньше относительно предыдущего значения и запустите программное обеспечение для сбора данных, чтобы получить 26 последовательностей, сместив каждую последовательность на две миллисекунды от предыдущей. Чтобы обработать захваченные видео, запустите программное обеспечение Leica Application Suite X или LAS X и откройте созданный проект.
Затем нажмите «Экспорт» и сохраните как сохранить кадры в формате TIF в папке назначения. Затем запустите программное обеспечение ImageJ и нажмите на файл, импорт и последовательность изображений. В окне открытия последовательности изображений выберите папку назначения и откройте первый кадр.
В параметрах последовательности перейдите к начальному полю изображения и установите номер кадра равным единице для первого кадра. Затем в поле приращения установите значение, равное количеству кадров в начальной записи сигнала, прежде чем нажать кнопку «ОК». Чтобы сохранить сгенерированный файл сшитых первых кадров в отдельную папку, нажмите на вкладки файл, сохранить и папку по порядку.
Повторите процедуры для 19 кадров, установив соответствующий номер кадра в поле начального изображения. Когда все изображения будут получены, нажмите на файл, импорт и последовательность изображений, чтобы выбрать один в начальных полях изображения и инкремента. Можно увидеть финальное видео со всеми кадрами, сшитыми вместе с увеличенным временным разрешением.
Затем сохраните видеофайл в формате TIF. Чтобы проанализировать сшитое видео, нажмите на изображение, стеки, инструменты и сортировщик стеков. Затем перейдите к анализу, инструментам и менеджеру ROI.
Перетащите TIF-файл, сохраненный ранее, в окно ImageJ, а затем разверните изображение для лучшего просмотра. Чтобы улучшить визуализацию изображения, нажмите на изображение, отрегулируйте, чтобы включить контраст яркости в авто. Установите фон близко к нервному терминалу, нарисовав ROI и добавив ценность менеджеру ROI.
Затем рассчитайте фон, нажав на more и multi measure. Скопируйте средние значения для вставки в программу для работы с электронными таблицами. Затем рассчитайте среднее значение.
Затем вычтите вычисляемое среднее значение из стеков, щелкнув процесс, основной и вычтите. Введите полученное значение и нарисуйте ROI вокруг нервного терминала через полигональную линию, прежде чем добавлять его в менеджер ROI. Измерьте переходную интенсивность нервного терминала, щелкнув больше и несколько измеряя вкладки.
Затем скопируйте средние значения интенсивности и вставьте их в программу для работы с электронными таблицами, чтобы рассчитать среднее смещение сигналов. Разделите значения сигнала на среднее значение смещения. Из полученного значения вычтите единицу, а затем умножьте на 100%, а затем постройте график переходных процессов кальция для определения амплитуды.
После загрузки нервного препарата красителем большая часть синапса располагается близко к культе нерва, указывается достаточный уровень флуоресценции. После обработки изображения была получена теплотечная передача кальция с требуемым пространственным и временным разрешением. Одним из наиболее важных шагов в этом протоколе является то, что культя нерва должна быть помещена в краситель, содержащий раствор, в первые несколько минут после разрезания нерва.
Этот метод может быть использован для загрузки различных красителей и лекарств в двигательные нейроны. Протокол регистрации может быть полезен для оценки кальция в дендритах и шипах в препаратах ЦНС. Наша методика позволяет регистрировать кальциевый сигнал с хорошим пространственным и временным разрешением.
Изучение быстротечности кальция является мощным инструментом в исследованиях регуляции высвобождения нейротрансмиттера и синаптической пластичности.
