我々は、ビデオ編集の彼の支援のためにヤコブソリスに感謝したいと思います。 この作品は、MJのレーベンへのNSFキャリア賞、DBI-0953902によって部分的に資金を供給された。

1。動物灌流5と全体のマウス脳のクリア<ol><li>手続きの全体の長さは、脱水工程ごとに使用される時間の長さによって異なりますが、合計で全体のプロセスは2日間で実施することができる。 </li><li> YFPマウスを計量してから、深くケタミン/キシラジン（100 mg / kgを10 mg / kg）の腹腔内注射で麻酔。 </li><li>手術に進む前に、深い麻酔の外科プレーンを確認します。動物にそれがしっかりとつま先やテールピンチに反応するかどうかを確認するために5分毎にチェックマークを付けます。動物が反応する場合、ケタミン/キシラジンの補足用量（元用量の1/3）が必要です。 </li><li>一度深く麻酔し、マウスが手術のためにその胸を露出して、仰臥位（背recumbancy）になるように、ラボのテープを使用して手術台に各肢を接着することで、マウスを抑制する。手術台は、通常、金属やプラスチック製のメッシュで作られており、シンクにまたは口を閉ざしてパンの上に置かれるように血液や固定廃棄物は、容易に収集することができる。 </li><li>開始するには、xyphoidプロセス下切開を行います。はさみとピンセットを使用して、胸郭のベースに沿ってカットし、カットがなされると同時に皮膚を引き戻す。心臓が露出したままに止血剤を用いて胸腔から離れて保持されている組織のフラップを作成するために、マウスの胸骨の両側（リブを介して）に沿って2つのカットを行います。 </li><li>心臓の左心室に23グラムの針を挿入し、血液を逃がすために、右心房の筋肉の壁に小さな切開を加える。この手順のビデオの記事2497 Joveのために参照してください。5 </li><li> 40ミリリットル約5の割合で - 右心房が切断された直後に、血液がもはや心臓の右心房（30から排出が観察されなくなるまで°Cのリン酸緩衝生理食塩水、PBS液（pH7.2）をバッファリングされた4による灌流を開始ml /分）。 </li><li>一度、すべての血液は（右心房を出る流体がクリアされている）排出された、冷やした4％に灌流媒体​​を切り替えるPFAのソリューションを提供します。マウスの体がタッチ（ - 約5ml /分の速度で40ミリリットル約30）に著しく剛性とコールドになるまで灌流する。 （濃縮16パーセントのPFA溶液はメーカーの指示およびpH 7.2に到達するまでNaOHを加えているに応じて希釈される。手袋と白衣を着用し、ドラフト内部の化学物質を扱うと混ぜる。） </li><li>灌流後、手術台からマウスを削除して、脳の切除を開始するために首をはねる。 </li><li>鉗子および虹彩のはさみを使用して、頭蓋骨の裏から始まり、前進小さなセクションで頭蓋骨を削除します。慎重に小さなセクションでは、脳から離れて骨を引っ張るために鉗子を使用しながら、頭蓋骨全体ではさみで4ミリメートル - 小さな切り傷毎に2を加えます。脳の上面全体が露出されるまでこれを行う。 </li><li>ガラスバイアルに幅5mm、平らなへらと場所を使って頭蓋骨から脳を切除する。ポスト固定のため4時で6時間4％PFA°Cで水没。 </li><li> POSTの終了後に固定、ガラスバイアルのPFAを注ぎ、PBSでそれを置き換えることにより、室温でPBSで2回脳を洗う。注ぐと第二の洗浄PBSで交換する前に、PBS溶液中で渦脳を。 </li><li>傾斜インキュベーションあたり2時間でエタノールのインキュベーションのシリーズ（一回で50％、70％、95％、二回では100％）、次いで第2の100％エタノールのインキュベーションのための12時間で、室温で脳を脱水するかに固定組織から水を抽出します。各インキュベーションについては、ガラスバイアルから前のエタノール溶液を注ぐと脳が完全に水没するまで、後続のソリューションに置き換えます。 </li><li> 100％エタノール中で第二のインキュベーションした後、溶液を注ぐと等量のエタノールとベンジルアルコールと安息香酸ベンジル（1:2容量：容量比）を含む決済ソリューションと交換してください。インキュベーションの2時間後、この溶液をデカントし、ベンジルアルコールと安息香酸ベンジル（1:2容量：容量比）の100％溶液と交換してください。 refra決済ソリューションのctiveインデックスはN = 1.54である。 </li><li>一度Babbの中で、脳は4内で、著しく透明になる - 5時間。最高の清算の結果を得るには、明るい光から遮蔽しながら室温で6日間クリアする脳のままにしておきます。 </li></ol> 2。顕微鏡のセットアップ<ol><li>脳をイメージングのためにクリアされ、準備された後、シャーレの底に貼り、それはシアノアクリレートを使用して。接着剤は、先に進む前に乾燥することができます。 </li><li>乾燥させた後、水没Babbの中で、脳やイメージングのための顕微鏡対物レンズの下にペトリ皿を置きます。 </li><li>我々は、990 nmの励起波長〜710 nmの間で調節可能マイタイチタンサファイアレーザーを組み込んだ多光子顕微鏡を使用しています。我々はYFP信号を生成するために使用する励起波長は886 nmである。レーザーパワーは30から変化 - 100 mWの撮像深度に応じて。 </li><li>大が可能ニコン5X客観数（NA、0.5）を用いた反射蛍光シグナルを捕捉視野イメージング（2×2 mm）です。 </li><li> 50分の535のバンドパスフィルタを用いた反射蛍光信号をフィルタリングし、GaAsPのPMT（H7422PA-40、浜松、ブリッジウォーター、ニュージャージー州）を用いて、それを集める。 </li><li>プロセスイメージは、高解像度のYFP画像を生成するために行あたり2ミリ秒のスキャン速度を使用して2048×2048ピクセルの解像度でscanimageでもソフトウェアを使用する6。 </li><li>一度撮影が完了すると、将来のイメージングのために遮光鉗子とBabbの中でストアを使用してペトリ皿から脳を除去します。糊付けサンプルについては、30度を超えない角度で接着剤やシャーレの間にカミソリの刃を実行することにより、組織を除去する。私たちは、目に見える劣化で最大1年間Babbの内のサンプルを格納しました。 </li></ol> 3。代表的な結果ここに示されている代表的な画像や動画は、高分解能多光子イメージングの能力を実証する光クリアによって可能となった。脳全体のイメージングが可能に海馬と皮質の異なる層のニューロンが組織表面下に2ミリメートルのような深いようにはっきり見えるようにYFPを標識するための図1は、尾2.92ミリメートルで、海馬の解剖学的特徴に対応した冠状断像の代表的なイメージを示していブレグマ7。サンプルのイメージングの深さは1.94 mmであった。この違いのいくつかは、脳の尾側で小脳を除去したことによるものとバランスが脱水プロセスからの収縮によるものであった。スタックから別の画像は、組織表面（ 図2）の下に2ミリメートルYFPを発現する新皮質の層V / VIの錐体細胞を示しています。すべての画像はニコン5X客観的かつ倍率がscanimageでもソフトウェアでの画像取得のためのデジタルズーム機能を使用して行われていた使用して取得した。 新皮質にズームインすることで、新皮質V層錐体細胞の個々の軸索と神経細胞体は明確であるLY組織表面下の1.02ミリメートル（ 図3）まで区別できる。 図3から画像スタックを使用して、ニューロン領域の3D再構成はImageJのソフトウェア8（ 図4）を用いて作製した。 MPMの高解像度能力はまた、私たちは全体、個々のニューロンの画像を提示することができます。ここでは、個々の樹状突起がはっきりと見えるされる新皮質（ 図5）のV層錐体ニューロンの再建を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig1.jpg" /> 図1 1.2ミリメートルの画像スタックからの代表的なイメージ（0.8 -組織表面下に2ミリメートル）。新皮質と海馬の異なる層を示す全体のマウスの脳の。海馬の機能には、1.1ミリメートル組織表面下に表示され、フォローを用いて標識されたるコード番号：DGのDG =歯状回、GrDG =顆粒層、Lmol = lacunosum moleculare層、モル=分子層、DG、または= oriens層、PoDG =多形層、DG、PY =錐体細胞層、RAD =地層放線7。画像のサイズは1.8×1.8ミリメートル、スケールバー=200μmである。脳の吻側端は客観側に向け、尾方端でシャーレに固定した。これは、前頭面での撮像を容易にした。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig2.jpg" /> 図2 1.2ミリメートル画像スタック（0.8 -組織表面下に2ミリメートル）からの代表的なフレーム。新皮質を強調全体マウス脳の。大脳皮質の層のV / VIにYFPを発現錐体細胞およびプロセスは、組織表面の下に表示2mmである。標識の程度は、新皮質のまばらなラベリングの以前の報告と一致しています。折り込み9（右） は bから拡大されている<html>左のoxedエリア。画像のサイズは1.8×1.8mmで、スケールバー= 200ミクロン（50μmの挿入図）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig3.jpg" /> 図3代表的なフレームは脳の新皮質のV層錐体ニューロンの画像スタックから組織表面下に774μmを撮影。スタックは700μmから組織表面下の1020μmに行く。 8Xデジタルズームはこのような微細プロセスなどの詳細をキャプチャするために使用された。画像のサイズは225×225μmのスケールバー=20μmである。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig4.jpg" /> 図4：図3の画像スタックの3次元再構成の代表画像（225×225×320μm）である。画像のサイズは225×225μmのスケールバー= 28μmである。 s &quot;は&gt; <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig5.jpg" /> 図5 10倍デジタルズームを使用して新皮質V層錐体ニューロンの高分解能再構成画像。ニューロンは、長さが485μmのスケールバー=25μmを測定します。各画像タイルの視野を180μm×180μmである。各タイルは、異なる奥行き（Zレベル）である。皮質先端樹状突起は、一般的な、急行YFPと同様ソーマで、しないでください。ここに示すように、同一視野内に両方持っていると、電源がソーマの彩度を最小限にするために低下したが、これは微細なプロセスの一見の調光を行います。ここで我々の重点は視野ではなく、細かいディテールを実証していた。細かい詳細を明らかにするために、相馬ない領域に焦点を当て、デジタルズームを使用し、レーザーパワーを上げる。

<ol>
	<li>Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+organs.">Multiphoton microscopy of cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).</li><li>Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence,+second+harmonic+generation,+and+fluorescence+lifetime+imaging+of+whole+cleared+mouse+organs.">Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+insect+and+mammalian+embryo+imaging+with+confocal+microscopy:+Morphology+and+apoptosis.">Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis.</a> Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).</li><li>Sakhalkar, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+in+bulk+tissue+specimens+using+optical+emission+tomography:+Fluorescence+preservation+during+optical+clearing.">Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing.</a> Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).</li><li>Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-mouse+Neuroanatomical+Magnetic+Resonance+Imaging.">Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging.</a> J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 2, (2003).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Hama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).</li></ol>

動物実験では、エール大学の機関アニマルケア＆使用委員会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。

標準的な有機色素は、有機溶媒の範囲と互換性があり、したがって、プロトコルをクリアするために特定の課題を提起していませんが、蛍光タンパク質は、溶媒中に変更されることが多いの耐性が低下します。本研究の4つの目標は、重大な限界を克服することであったXFPを蛍光が消失または著しく低下していた以前の光学クリアプロトコル。ここで提示されている画像はYFPの蛍光が?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>シグマアルドリッチ社</td><td> D8537 </td><td> 500ミリリットル、pHは7.2 </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15710 </td><td> 10×10ミリリットル、16％パラホルムアルデヒド</td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>バイオ分析アメリカン</td><td> AB00515-00500 </td><td> 500ミリリットル、200プルーフ</td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td> Pharmco·プロダクツ</td><td> 111000190 </td><td> 1ガロン、190プルーフ</td></tr><tr><td>ベンジルアルコール</td><td>シグマアルドリッチ社</td><td> 402834 </td><td> 500ミリリットル、99 +％ </td></tr><tr><td>安息香酸ベンジル</td><td>シグマアルドリッチ社</td><td> B6630-IL </td><td> 500ミリリットル、≥99％ </td></tr><tr><td> 5X/0.5 NA対物</td><td>ニコン</td><td> 5Xアリゾナプラン小麦粉</td><td> 15 WD </td></tr></tbody></table>

multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing yfp

全体マウス器官の固有蛍光と第二高調波発生（SHG）の多光子顕微鏡は、光学イメージング前器官をクリアすることによって実現されています。1,2しかし、このようなGFPとYFPなどの蛍光タンパク質を含む器官、メタノールを使用した光クリアプロトコルのベンジルアルコールを使用して脱水およびクリアライト3から保護されていないながら、安息香酸ベンジル（Babbの）は、蛍光シグナルを保持しません。ここで紹介するプロトコルは、神経細胞で発現YFPの蛍光シグナルを保持したまま、マウスの脳で臓器全体の光のクリアを実行するためにした斬新な方法です。臓器が蛍光タンパク質へのダメージを軽減し、多光子イメージングのための彼らの蛍光シグナルを維持するために発見されているエタノール傾斜シリーズを用いて脱水であること、このような光学決済プロトコルを変更すること。4エタノールベースの脱水と光学清算の最適化された方法を使用するとBabbのでクリア遮光しながら、我々は、組織表面の下に2ミリメートル以上のマウスの脳のニューロンにおける黄色蛍光タンパク質（YFP）式の高解像度多画像を示す。

Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP at JoVE.com

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

全体マウス器官の多光子顕微鏡は、光学的にイメージを作成する前に臓器をクリアすることにより可能ですが、そうでない場合、すべてのプロトコルは、蛍光タンパク質の蛍光信号を保持します。エタノールベースの​​脱水およびベンジルアルコールを用いて光学クリア方法を使用する場合：安息香酸ベンジルのクリアは、YFPを発現全体のマウスの脳の高解像度多画像を示す。

YFPを発現クリアマウス脳の多光子顕微鏡

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

multiphoton-microscopy-of-cleared-mouse-brain-expressing-yfp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K ビュー.  Yale University. 全体マウス器官の多光子顕微鏡は、光学的にイメージを作成する前に臓器をクリアすることにより可能ですが、そうでない場合、すべてのプロトコルは、蛍光タンパク質の蛍光信号を保持します。エタノールベースの​​脱水およびベンジルアルコールを用いて光学クリア方法を使用する場合：安息香酸ベンジルのクリアは、YFPを発現全体のマウスの脳?...

ビデオ: Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

神経科学

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

フローサイトメトリーを用いてマウスの内耳の組織からのLacZの発現細胞を単離する

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

共焦点光シート顕微鏡全体マウスの脳のミクロンスケールの分解能光トモ

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

マウス脳血管の精製

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...