このプロトコルはDNAのカーテンの技術がchromatinの原動力を調査するために、特にヒストンのシャペロンの分子機能を調査するためにいかに利用されるか示す。ハイスループットな1分子イメージング技術 DNAカーテンは、バルク実験の限界を克服し、リアルタイムイメージングを容易にし、生体分子相互作用の詳細な特性評価を可能にします。両面テープの中央に5×35ミリメートルのきれいな紙を置きます。
スライドにテープを貼り、2つの穴とナノパターンを紙で覆います。次に、きれいな刃を使用して紙を切除します。両面テープの上にガラスカバースリップを置き、ピペットチップでカバースリップをこすり、マイクロ流体チャンバーを形成します。
組み立てたフローセルを2枚の顕微鏡スライドの間に置き、クリップで留めます。フローセルを摂氏120度の真空オーブンで45分間焼きます。ホットグルーガンを使用して、チップベースの分析用の流体コネクタを各開いた穴に取り付けます。
そして、ルアーロックチューブの2本の線を接続します。3ミリリットルの脱イオン水が入ったルアーロックシリンジを接続し、チャンバーを洗浄します。ドロップバイドロップ接続により、3ミリリットルの脂質緩衝液でチャンバーを再度洗浄します。
脂質バッファー中の 0.04x ビオチン化脂質 1 ミリリットルをチャンバーに 2 回に分けて注入し、1 ショットあたり 5 分間のインキュベーションを行います。1ミリリットルのBSAに1ミリリットルあたり0.025ミリグラムのストレプトアビジンを2回のショットで注射し、1ショットあたり10分間のインキュベーションを行います。約30ピコモルのビオチン化ラムダファージDNAを1ミリリットルのBSA緩衝液に2ショット、1ショットあたり10分間のインキュベーションでチャンバーに注入します。
10ミリリットルのイメージングバッファーが入ったシリンジをシリンジポンプに接続し、マイクロ流体システムのすべてのチューブラインで気泡を除去します。準備したフローセルをドロップtoドロップ接続でマイクロ流体システムと結合し、フローセルへの気泡注入を防ぎます。フローセルとフローセルホルダーを組み立て、カスタムメイドの全反射蛍光顕微鏡に取り付けます。
200マイクロリットルのYOYO-1色素をイメージングバッファーに100マイクロリットルのサンプルループを通して注入し、ラムダDNA分子を染色します。イメージングソフトウェアを実行し、488ナノメートルレーザーをオンにして、DNAカーテンが整形されているかどうかを確認します。YOYO-1色素を除去した後、インキュベートしたタンパク質サンプルを注入します。
タンパク質がDNAカーテンに到達したら、シリンジポンプをオフにし、シャットオフバルブをオフにし、15分間インキュベートしてAbo1によるヒストンローディングを行います。結合していないAbo1タンパク質とヒストンタンパク質を5分間洗い流します。バッファーフローを一過性にオフにして、ヒストンタンパク質がDNAにロードされているかどうかを確認します。
DNAカーテンの形成は、DNA分子を補間色素で染色することによって確認しました。平行に並んだ緑色の線は、DNA分子に挿入されたYOYO1が、流体力学的流れ下で拡散障壁でよく整列し、引き伸ばされていることを示しています。Abo1の非存在下でCy5-H3-H4二量体をDNAカーテンに注入すると、Cy5-H3-H4はDNAに結合せず、H3-H4二量体がDNAに自発的に結合していないことが示された。
Cy5-H3-H4にAbo1を注入すると、DNA分子に赤色蛍光の点状が見られ、Abo1がH3-H4二量体をDNAにロードしていることが示唆された。蛍光シグナルはバッファーフローの非存在下では消失し、フローが再開されると再び現れ、H3-H4二量体がDNAに結合することを示唆しています。H3-H4二量体のDNAへの結合は、流れを止めるたびに蛍光シグナルが消えるキモグラフによっても確認されました。
ヌクレオチドの非存在下またはADPの存在下で、DNAカーテンに蛍光点がほとんど現れず、H3-H4二量体がApo状態またはADPの存在下でDNAに結合することはめったにないことを示しています。定量分析は、ATPの存在下でDNAに結合したH3-H4二量体の数が増加することを示しています。この結果は、ATP加水分解がAbo1によるH3-H4のDNAへのロードに必須であることを示唆しています。
フローセルへの気泡注入を避けることは、すべてのステップで最も重要なことです。そのため、このプロトコルでは、ドロップバイドロップ接続を重視しています。DNAカーテンアッセイは、デュアルナノパターンを持つダブルテザーDNAカーテンに拡張できます。
さらに、一本鎖DNA、RNA、またはアクチンフィラメントを使用して別のタイプのDNAカーテンを作成できます。DNAカーテンは、DNA上のタンパク質の動きを可視化し、標的探索機構の研究を容易にします。DNAカーテンは、複製や転写などのDNA代謝を研究するために拡張することができます。
