我们要感谢爱荷华州立大学兽医诊断实验室的员工，即海莉·兰伯特，艾米丽·拉赫，罗莎琳·布拉纳曼，维多利亚·格林和詹妮弗·格罗尔茨-画眉，及时处理样品。我们还要感谢乔迪·史密斯和贝桑·瓦伦丁为渗透率实验提供了材料。我们还要感谢大卫·迪亚兹-里根对图 9 的帮助。除图 6 外，所有数字均以 BioRender.com 创建。作者希望感谢教师创业公司，ISU VPR米勒奖，ISU VPR米勒奖和NSF SBIR子奖项对ISU # 1912948的支持。

该研究获得批准并按照爱荷华州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC-19-337;国际药典-18-065;国际协调理事会-19-017）。下一节（步骤 1.1-1.3）介绍了渗透性支持播种协议， 图 3 总结了这些步骤。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig03.jpg"> 图 3：渗透性支持播种方案的工作流程。 渗透性支撑插入物用CMGF + R / G，胶原I和细胞外膜基质的组合预涂并随后孵育。吸出来自犬类器官培养物的培养基并用细胞恢复溶液替换，然后在4°C下孵育30分钟。 随后将培养物转移到管中，并使用胰蛋白酶样蛋白酶进行类器官解离。通过过滤器去除未分离的类器官以获得单细胞悬浮液，并使用血细胞计数器或自动细胞计数器测定细胞浓度。将细胞接种在可渗透的支撑插入物上，并将CMGF + R / G添加到基底外侧室中。然后将培养物孵育24小时，并将剩余的液体从顶端室中取出并用CMGF + R / G代替。GSKiβ = 糖原合酶激酶β;CMGF + R / G = 具有通过岩石抑制剂和GSKiβ增强的生长因子的完整培养基。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
1. 渗透性支持播种方案
<ol><li>渗透性支撑嵌件的预涂层<ol>
<li>根据 表1中的信息，制备具有用Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂和糖原合酶激酶-β抑制剂（GSKiβ）（CMGF + R / G）增强的生长因子的完整培养基。</li>
		<li>准备一个冰桶，开始在冰上解冻细胞外膜基质。将包含所需插入片段数的24孔板放入培养箱中以进行预热。收集大鼠尾巴胶原蛋白I（3毫克/毫升）并将其放在冰上，同时避光。收集超前生长因子 + R/G 并将其放在冰上。</li>
		<li>计算实验所需的插入片段和空白的总数，为每个插入片段保留100μL包衣溶液。 注意：准备比所需更多的涂层溶液;建议至少准备比需要多15%。</li>
		<li>在15mL管中，将CMGF + R / G与细胞外膜基质（1%）和胶原I（1%）混合，然后轻轻移液混合物。</li>
		<li>用100μL包衣溶液涂覆每个聚酯插入物，并将插入物置于培养箱（37°C; 5%CO2 气氛）中1小时。</li>
		<li>孵育后，使用真空吸出器或P1000移液管小心地从每个插入物上吸出包膜溶液，注意不要干扰插入物过滤器。将预涂好的板放入培养箱中保温。</li>
	</ol></li>
	<li>犬类器官解离 注意：使用已经培养至少四天的犬类类器官。在开始解离之前，参考Gabriel等人38 来确定样品何时健康，致密且足以进行实验。建议在每个孔电镀程序中解离一个额外的类器官孔。此外，建议将所需插入片段的数量增加约20%，以解释不均匀的类器官生长或由不当操作引起的损伤。如果计划使用FITC-葡聚糖，请准备额外的孔。<ol>
<li>在生物安全柜中准备一个冰桶和一小瓶冷的1x高级DMEM / F12储备。</li>
		<li>将细胞外膜基质放在冰上开始解冻，将其浸入冰中以防止快速解冻并避免凝固。将一盒移液器吸头（P200）放入冰箱中，用于细胞外膜基质的电镀。</li>
		<li>将冷冻离心机预冷至4°C。</li>
		<li>将 CMGF+ R/G 从冰箱/冰箱移至 37 °C 水浴中。尽可能避免直射光线。</li>
		<li>用类器官培养物从24孔板中取出所有培养基以获得适当数量的孔（每2-4个插入片段24孔板的1孔），同时注意不要干扰细胞外膜基质。 注意：体积可能因所使用的细胞计数系统而异。</li>
		<li>每孔加入0.5 mL预冷细胞回收溶液以溶解细胞外膜基质圆顶。</li>
		<li>将板在冰箱（4°C）中孵育30分钟。</li>
		<li>移液悬浮液，收集所有类器官和溶解的细胞外膜基质，并将其转移到15 mL管中。</li>
		<li>离心（700× g 在4°C下5分钟）并除去上清液，直到水平达到0.5mL标记，确保不干扰沉淀。</li>
		<li>加入1mL胰蛋白酶样蛋白酶，并在37°C水浴中孵育8分钟。在孵育期间轻拂管几次以混合细胞。</li>
		<li>将带有样品的试管转移回生物安全柜，并缓慢加入7 mL预冷的AddEM / F12以灭活胰蛋白酶样蛋白酶并停止细胞解离。</li>
		<li>用 1 mL 高级 DMEM/F12 预拭 40 μm 细胞滤网。轻轻移取混合物并过滤悬浮液;移液器附加高级DMEM / F12以冲洗过滤器。</li>
		<li>在4°C下离心管（700× g5 分钟）并除去上清液。请勿打扰颗粒。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于约50-100μL培养基（CMGF + R / G）中，用于解离的每个类器官孔。</li>
		<li>使用血细胞计数器或适当的机器计数悬浮液的子样品（〜10μL），并确定悬浮液中的总细胞数。</li>
	</ol></li>
	<li>犬类器官播种<ol>
<li>稀释或浓缩细胞悬浮液，以获得每毫升约75，000个细胞的细胞浓度。</li>
		<li>将100μL悬浮液的种子放入每个插入片段中，使用BSA（1%）预涂包封尖以避免细胞在转移过程中粘附。添加一个涂层插入物作为无细胞空白，没有任何类器官生长，同时仍接受常规的培养基更换。</li>
		<li>以圆周运动轻轻旋转板约30秒，以将接种细胞分散在插入片段上。通过光学显微镜确认细胞的均匀分布。</li>
		<li>向基底外侧室中加入700μL CMGF + R / G，并将板置于培养箱（37°C; 5%CO2 气氛）中24小时。</li>
		<li>24小时后，轻轻地从顶端室中取出细胞悬浮液，并用200μLCMGF + R / G替换它，将板返回到培养箱中。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 类器官细胞单层维持方案
注意：以下部分（步骤2.1-2.2）描述了类器官细胞单层维护方案。 图 4 总结了该协议中介绍的过程的工作流程。 补充表1中提供了一个笔记表，可以帮助TEER值测量的标准化。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig04.jpg"> 图 4：渗透性支持培养物维护的工作流程。 TEER值使用电极（探头）和伏特/欧姆表进行测量。探头在插入孔中之前，必须用70%的酒精进行化学灭菌。测量空白和类器官细胞插入物，并计算TEER值。随后在顶端和基底外侧腔室中刷新培养基，并使用光学显微镜观察插入物上的犬类器官培养物。根据方案记录和处理类器官培养物或微孔膜中的撕裂。简称：TEER = 经上皮电阻。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<ol><li>透射率值测量 注意：TEER值测量使用带有筷子附件的上皮伏特/欧姆计进行。请参阅制造商的使用说明。TEER值提供有关犬类器官单层完整性的信息。<ol>
<li>在细胞培养生长期间每隔一天进行TEER值测量。</li>
		<li>将上皮伏特/欧姆计及其电极移至生物安全柜。使用前用70%酒精对电极进行化学灭菌。将函数设置为欧姆。等待至少一分钟，直到电极变干。</li>
		<li>在进行第一次测量之前，将线电极插入端口并打开电源。确保仪表显示 1，000 Ω，带电极插件，而不是测量筷子。如果不是这种情况，请调整设备。</li>
		<li>将电极插入无细胞插入物（空白）的顶端和基底外侧室中，因此顶端室包含较短的电极，基底外侧室包含较长的电极（如图 4所示）。不要触摸膜，但同时要确保电极浸没在介质中。</li>
		<li>等待几秒钟，直到值稳定下来，并在实验书中记下该值。测量剩余的犬类有机体单层，确保在测量不同样品时用70%的酒精对电极进行灭菌。注意不要用电极接触类器官单层。</li>
		<li>测量后，最后一次用70%酒精对电极进行灭菌。请务必保护它们免受不当操作造成的损坏，并根据制造商的说明进行存放。</li>
		<li>使用等式 （1） 计算每个孔的TEER值，其中R样品 和R空白 分别是来自单层和空白孔的欧姆（Ω）值，面积（cm²）是插入片段的面积（cm²）。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq01.jpg" style="margin: auto;"> （1）</li>
	</ol>
</li>
	<li>单层维护 注：查看 表 2 中建议的介质更改计划。<ol>
<li>使用无菌的一次性9“巴斯德移液器和真空吸气器，轻轻地从顶端吸出培养基，然后从基底外侧腔吸出培养基。倾斜板以清楚地看到介质表面。避免吸入太靠近顶端室中的微孔膜，以防止损坏细胞单层。 注意：在样品之间移动时使用新的巴斯德移液器。移液器也是该程序的可能替代品。</li>
		<li>使用 P1000 移液器缓慢加入 CMGF+ R/G，靶向顶端或基底外侧室的壁。在顶端腔中非常小心地进行介质更换，以避免损坏单层。</li>
		<li>每隔一天在光学显微镜下检查孔，评估培养物的健康状况并监测类器官单层或微孔膜中的撕裂。使用相差显微镜突出显示培养物的细节。 注意：在犬类类器官单层撕裂的情况下，单层有时间恢复和再生。在微孔膜撕裂的情况下，必须将孔排除在实验之外。</li>
	</ol>
</li>
</ol>表2：类器官培养的培养基更换建议。 CMGF + R / G每隔一天在每隔一天的孔的顶端和基底外侧室中改变一次。周末较长的培养期要求在基底外侧和顶端腔中增加培养基的体积，该培养基在周五下午施用，并在周一更换。缩写：ROCK = rho相关激酶;GSKiβ = 糖原合酶激酶β;CMGF + R / G = 具有通过岩石抑制剂和GSKiβ增强的生长因子的完整培养基。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%202%20(5).xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>
3. 渗透率实验方案
注：以下部分（步骤 3.1-3.5）介绍了渗透率实验方案。测量药物 体外 通透性的实验方案工作流程总结在 图5中。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig05.jpg"> 图5：实验方案的工作流程。 在接种插入片段后8至12天之间，必须将类器官培养基从CMGF + R / G更改为CMGF +，以便进行细胞分化。将培养基（顶端和基底外侧）改为CMGF +后，TEER值仍应增加，犬类器官单层几乎达到汇合。在培养基变为CMGF +后至少四天，评估单层的准备情况。当单层完全形成，并且TEER值达到平台阶段（通常在1，500和2，500 Ω.cm2之间）时，将培养基更换为运输缓冲液30分钟，以使单层适应新环境。在实验时间为0分钟时，进行FITC-葡聚糖测定，并收集20分钟基底外侧样品。随后在读板器上分析结果。实验结束后，将顶端和基底外侧腔内容物再次更改为CMGF +，并获取TEER值读数。将单层孵育24小时，并通过重复的TEER测量评估单层的完整性。缩写：TEER =跨上皮电阻;岩石 = 罗氏相关激酶;GSKiβ = 糖原合酶激酶β;CMGF + R / G =具有用岩石抑制剂和GSKiβ增强的生长因子的完全培养基;CMGF+ = 具有生长因子但不含岩石抑制剂或GSKiβ的完全培养基;FITC = 异硫氰酸荧光素;F = 荧光。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<ol><li>评估类器官单层的准备情况 注意：此步骤在播种后 8-14 天进行。<ol>
<li>至少每隔一天在光学显微镜下检查一次单层（使用相差来可视化单层的完整性）。当细胞单层完全形成而没有间隙或明显的撕裂迹象时，继续下一步。</li>
		<li>将类器官培养基从CMGF + R / G更改为CMGF +（不包括培养基成分中的岩石抑制剂和GSKiβ）。建议在实验前至少四天更换培养基。 注意：此步骤将允许类器官单层的适当分化。</li>
		<li>继续测量大约每隔一天测量一次TEER值。当TEER值开始稳定在大约1，500至2，000 Ω ×平方厘米（图6）时，每天测量TEER值。 注意：这种稳定状态可以保持大约2-3天，这是执行渗透性测试的最佳时间窗口（通常在第11至13天）。高原TEER值可能会根据类器官的肠道定位，测量温度，品种，年龄和狗的疾病状态而略有振荡。</li>
		<li>立即安排药物渗透性测定，以避免TEER值迅速下降或类器官单层过度生长到多个细胞层。</li>
	</ol></li>
	<li>准备实验 注意：在实验过程中可以使用培养箱振荡器，以避免无结垢水层的影响。在一致的温度下测量TEER值。<ol>
<li>在实验当天，测量TEER值并确认值达到稳定状态并且没有迅速下降。</li>
		<li>从过量的20%插入物中选择最佳的单层（通过光学显微镜和TEER值）来执行实验。</li>
		<li>在光学显微镜下观察单层，并排除不完整，撕裂或过度生长的类器官单层。</li>
		<li>准备转运缓冲液并将其pH值调整为所需值。 注意：实验缓冲液的组成因实验设置而异。常用的缓冲液由汉克的平衡盐溶液（HBSS），葡萄糖（12.5 mM）和4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES，25 mM）组成。该组合物确保了实验期间类器官培养的可行性。</li>
		<li>小心地从所选孔的顶端和基底外侧室中吸出培养基。</li>
		<li>向顶端室加入200μL运输缓冲液，向基底外侧室加入800μL。 注意：运输缓冲液应首先添加到顶端室，然后添加到基底外侧室，以避免单层从微孔膜上脱落。</li>
		<li>将板置于培养箱（37°C; 5%CO2 气氛）中30分钟以平衡。 注意：犬类类器官单层现在已准备好进行药物渗透性实验。</li>
	</ol></li>
	<li>典型实验布局-IgY浓度溶液 注意：实验设计和布局可能会根据研究问题而变化。免疫球蛋白Y（IgY）通过类器官单层的渗透性在方案中用作示例，并且可以进行修饰。术语供体室是指最初应用药物的腔室，而接受室是指接受来自供体室的药物的室。典型的实验在2小时（例如，15，30，60，90，120分钟）的接收器室中收集样品。<ol>
<li>通过将IgY溶液溶解在运输缓冲液中以达到所需的最终浓度来制备IgY溶液（选择的药物或溶质）。准备比所需更多的药物溶液。 注意：水溶性低的药物可以先溶解在有机溶剂（例如乙醇，DMSO）中，然后再加入到缓冲液中。溶剂的最终浓度应小于1%，以免损坏电池单层。</li>
		<li>从每个孔的供体室（顶端或基底外侧室）中取出缓冲液。</li>
		<li>将IgY溶液（药物溶液）加入所有供体室。使用剩余的溶液作为时间0供体溶液来测量初始药物浓度。</li>
		<li>在所需的时间点，从接收室中取出50μL并将其置于标记的管中。在最后一个时间点，从供体室中取出样品。在实验结束时，将供体和受体等分试样转移到-20°C冰箱中。 注意：如果需要许多时间点，可以更换接收室中的缓冲液，但在计算表观渗透率时必须考虑在内。在实验结束时，在供体室中浓度不应超过供体室的10%，以保持沉没条件44。</li>
	</ol></li>
	<li>类器官细胞单层质量控制 注意：在实验过程中，FITC-葡聚糖溶液可用于确认单层完整性。FITC-葡聚糖被用作单层完整性测定的一个例子。其他包括路西法黄，PEG-4000，放射性标记的甘露醇和菊粉44。<ol>
<li>在0分钟时，吸取顶端室的内容物，并为每个实验组一式三份更换250μLFITC-葡聚糖溶液（5mg / mL，4 kDa）。 注意：不要将FITC-葡聚糖暴露在光线下。</li>
		<li>20分钟后，从基底外侧室中取出缓冲液。</li>
		<li>使用荧光板读数器测量基底外侧样品的荧光强度（使用校准曲线，激发设置为485nm，发射值设置为528nm）。 注意：FITC的P应用程序 也可以使用讨论中描述的方法计算。</li>
		<li>实验结束后，小心地从顶端和基底外侧腔中吸取多余的缓冲液。</li>
		<li>在顶端室中加入200μLCMGF +，向基底外侧室中加入700μL。</li>
		<li>测量各个孔中的TEER值。</li>
		<li>将板置于培养箱（37°C; 5%CO2 气氛）中24小时。</li>
		<li>如果适用，在24小时后，测量TEER值以评估在实验的质量控制部分对单层的可能损坏。使用光学显微镜可视化犬类器官单层的完整性。</li>
	</ol></li>
	<li>用于下游分析的固定细胞单层<ol>
<li>制备福尔马林 - 乙酸 - 醇溶液（FAA，组成在 表1中）。</li>
		<li>使用P1000移液器或无菌一次性9“巴斯德移液器和真空抽吸器从顶端和基底外侧室中取出运输缓冲液或CMGF +。</li>
		<li>用 FAA 填充顶腔和基底腔。</li>
		<li>24小时后，吸入FAA并用70%乙醇代替。</li>
		<li>用柔性实验室薄膜包裹板以防止蒸发并继续阻止制备。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig06.jpg"> 图 6：跨实验组的 TEER 值。 在五组犬肠类器官单层中测量TEER值。三组由犬空肠类组成，两组由类结肠组成。每组包括12至22次重复。空肠类培养物的TEER值从第4天到第14天显示，结肠培养物从第4天到第12天显示（测量结束于类器官单层达到稳态值，表明单层已准备好用于实验）。误差线表示测量的扫描电镜。简称：TEER = 经上皮电阻。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

K. Allenspach是利芬根动物健康和3D健康解决方案的联合创始人。她是Ceva动物健康，生物伊比利亚，生命诊断，安特诊断，迪尔兰益生菌和火星的顾问。J.P. Mochel是LifEngine动物健康和3D健康解决方案的联合创始人，并担任Ceva动物健康和精神动物健康的顾问。本文反映了作者的观点，不应被解释为代表美国食品和药物管理局的认可，观点或政策。其他作者没有任何利益冲突需要声明。

在可渗透支持装置中进行犬肠类器官培养是将传统药物通透性测定40 与新型 体外 犬模型41联系起来的独特概念。不同类型的犬肠类器官可以根据实验目标使用和评估，只需最小的调整。建议在每组3-4孔中测试多种浓度的目标药物。浓度可以基于药物的预期肠道浓度。此外，使用以前的研究可能有助于确定研究设计的适当时间点。应记录适当的研究设计文档，以提高可复制性并协助排除故障。
由于方法42的新颖性，该技术确实存在一些局限性，主要是由于实验设计和跨实验室执行协议缺乏标准化。这种缺乏标准化的问题已被其他43小组所承认，犬类3D类器官单层协议将导致实验室间再现性，并为该系统引入标准化。标准化的数据分析方法提高了可复制性，并且可以加强使用不同实验室渗透性支持系统中的犬类器官进行初步药物测试的结果。犬类3D类器官模型也缺乏将模型药物的 体外 Papp 值与其已知的人或犬 体内 肠道吸收进行比较的数据集，就像Caco-2细胞44，45，46一样。一旦生成了这些数据，就可以利用这种犬类器官模型来评估药物开发过程中的肠道通透性。
在可渗透支持系统上接种类器官时，必须小心谨慎，以接种足够高密度的适当解离细胞。当在严格的单层中生长时，系统的TEER值更加可靠和可重复。单层的长期培养可导致TEER值的指数增加，进一步达到肠道的生理值。然后，这种3D结构的H&E切片显示彼此上方的几层细胞，其肠细胞结构改变更靠近膜。
在犬肠类器官单层成功扩增后，可以通过计算药物的表观通透系数（Papp）公式44，以与传统2D细胞测定相同的方式分析结果。Papp 值（参见等式 （2））描述了在蜂窝单层47 上的传输速率。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> （二）
这是 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> 浓度与时间曲线（例如，nmol/s）的初始斜率。 A 是插入物的面积（cm2）， C0 是供体室中药物或化合物的初始浓度37。可靠识别单层完整性是需要标准化的渗透率测定的关键部分。建议使用光学显微镜和TEER测量来评估渗透性支撑系统中的犬类器官，并帮助确定实验的正确时间。此外，零分子渗透性标记（例如，FITC-葡聚糖，路西法黄，PEG-400）可用于功能评估类器官单层完整性。如果测试的化合物受到转运蛋白的影响，则必须注意。P-糖蛋白（P-gp）被用作常见的外排泵示例。必须与众所周知的P-GP探针基板进行比较，生成一个外排比（P应用，蓝方应用，美化聚糖蓝本）。
光学显微镜（普通或相衬增强）是检查2D或3D单层和滤光片插入物完整性，同时评估可能的细胞过度生长的宝贵方法。图7可以作为识别健康犬肠类器官细胞培养物的指南。TEER值是细胞间连接形成和类器官培养物分化成完整肠上皮的重要指标。犬肠类器官分化为肠细胞和高脚杯细胞（图6）。这些产生粘液的细胞允许研究药物 - 粘液相互作用，这是使用传统的2D细胞培养物48难以实现的。Chandra等人先前已在犬肠类器官中证实了肠内分泌细胞的存在。
提供了使用TEM进一步表征来自空肠，回肠和结肠类器官的犬类器官单层。TEM图像显示了细胞微结构，包括紧密连接和微绒毛形成，进一步说明了这些类器官模型在转化医学中的复杂性和有用性。根据实验结果，在可渗透支撑物上的类器官培养物已准备好在播种后第11天和第13天之间进行实验（图9）。此时的 TEER 值介于 1，500 和 2，500 Ω.cm2 之间。TEER值的平台阶段持续非常有限的时间窗口，其中必须在TEER值开始缓慢下降之前开始实验。TEER值也可能是显示重要实验结果的关键部分，因为某些药物或药物产品赋形剂可能与单层（例如，紧密连接）相互作用，这会极大地影响TEER值读数。仅此一点就可以作为实验的数据。
双室细胞培养装置中的犬肠类器官可以应用于口腔药物渗透性以外的领域，因为所得细胞单层具有独特的结构。例如，它们可用于微生物学研究（例如，改变胃肠道微生物菌群的影响），病毒摄取研究，药物间相互作用和药物运输机制49。供体室通常充满所选的测试药物或化合物，并且在不同的时间点从受体室中取出等分试样。这些等分试样可以使用高效液相色谱、质谱、酶联免疫吸附测定或其他技术进行分析，以确定溶质通过单层渗透的量和速度。
这些研究需要完整的单层才能准确评估药物渗透性。这通常需要生长超过无法使用的井所需的单层。类器官细胞单层也可用于测量单层顶侧或基底侧的病毒摄取，读数包括免疫荧光测定 - 利用抗体来检测病毒的细胞摄取。最后，可以将多种药物（即底物和抑制剂）施用于供体室，以鉴定基于转运蛋白的药物间相互作用。
根据目前的观察结果，这些方法将不仅适用于培养插入物中的犬类器官，而且还适用于其他兽医物种和器官系统，只需稍作修改以最适合所选物种或器官模型。犬肠类器官生长的方案必须根据培养物的独特性质进行调整。因此，该协议可以调整到另一个物种，但需要对协议进行细微的更改。修饰可以从细胞接种密度的变化开始，然后扩展到培养基组成的变化，以适当地区分感兴趣的类器官。
标准化、实验程序的详细记录以及对细胞单层的一致监测是渗透支持测定中所需的关键实践，并且不仅限于犬类系统。这些可能的物种或器官修饰对于记录和报告该领域的进一步发展至关重要。该模型有几个局限性，例如，其成本要求，实验室间变异性以及预测 体内肠道吸收能力的有限数据。在某些情况下，狗拥有与人类不同的药物转运蛋白和代谢酶50。
此外，犬类器官系统必须在来自其他制造商的各种其它双室设备上进行测试，以确定这种模型的适用性（例如，必须确定不同滤膜组合物的适用性）。另一个缺点是，手稿的药物渗透性实验部分比前几部分描述性较差。这是由此字段中的信息过多引起的。这部分手稿的目的是以可修改的方式描述这些方法，同时不削减这些实验的基石。Hubatsch等人收集了有关渗透率实验的更详细信息。此外，可渗透插入片段可用于共培养、细胞迁移和侵袭测定实验4.
总之，双室培养装置中的犬肠类器官具有用于广泛应用的潜力，包括生物医学领域和转化医学，仅举几例。这些协议创建了几种策略来计划实验，并促进整个生物学领域类器官模型的实验室间数据可靠性。

渗透性支持系统通常用于确定候选治疗药物通过肠上皮屏障1，2的表观渗透性。它们还可用于评估细胞分泌3，细胞迁移4和药物毒性5。 体外 口服药物渗透性测定是药物发现和开发过程中的关键步骤2，在药物研发生命周期的早期阶段对单个候选药物进行测试6。渗透性支撑系统是一种双室细胞培养装置，由放置在多孔板中的半孔膜的插入物组成。该系统允许直接进入在插入片段7中生长的细胞单层的顶侧和基底外侧。这些系统中使用的单层通常来源于胃肠道上皮细胞（例如，人结直肠腺癌Caco-2细胞系）8。细胞培养物在极化状态下生长，模仿肠上皮细胞的天然微结构，能够进一步分化细胞，类似的显微解剖学和功能7。透水支撑插件的详细信息可在 图 1 中找到。传统上用于评估肠道药物通透性的2D细胞培养物接种插入片段相对实惠且易于培养9。这些系统存在几个主要局限性，包括它们预测候选治疗药物10，11的肠道代谢能力有限。这适用于所有药物吸收机制，无论是通过上皮细胞之间的紧密连接处的被动吸收，通过外排的主动经上皮吸收，还是摄取转运蛋白（例如，P-糖蛋白，单羧酸盐转运蛋白1），以及由肠细胞代谢的药物。
狗与人类共享共同的环境和饮食12.犬肠解剖学和微生物组组成与人类13非常相似，这归因于过去36，000年的驯化和共享饮食14。不幸的是，这些相似之处也可能是疾病发展的常见原因/触发因素。狗发展出与人类相似的慢性发病率，例如肥胖15，炎症性肠病16，结直肠腺癌17，胃肠道间质瘤（GIST）18以及与相对长寿相关的各种其他病理19。因此，犬类器官可以成功地用于这些慢性多因素疾病的反向转化研究，本着“同一个健康倡议20”的精神。
Caco-2细胞是药物口服吸收测定中最常用的细胞系21。这些细胞目前被认为是体外肠通透性测定2，22，23的“金标准”模型。Caco-2细胞系表达在人肠道中发现的外排和摄取转运蛋白，尽管在不同的表达水平24，25，26下。Caco-2细胞也被广泛用作模型来确定药物是肠道外排转运蛋白的底物还是抑制剂22，27。虽然Caco-2细胞起源于结肠，但它们类似于肠细胞细胞。不幸的是，Caco-2细胞仅代表来自小肠9上皮层的一种细胞类型，其不能准确地概括复杂的肠上皮细胞类型组成。例如，Caco-2培养物中没有专用于粘液生产的杯状细胞，因此如果不与其他细胞系28共培养，就无法评估粘液 - 药物相互作用。此外，Caco-2 培养物不表达通常存在于肠道中的几种重要的核受体，例如孕酮 X 受体 （PXR）、类固醇 X 受体 （SXR） 和组成性雄甾烷受体 （CAR）29。因此，Caco-2 培养物无法模拟作为这些受体诱导剂的某些药物（例如利福平）对药物转运蛋白和酶的诱导30。
3D肠道类器官技术解决了其中的一些限制19.类器官是来自成体干细胞的自组装结构，可以从使用微侵入技术20收获的组织样本中建立。人诱导的多能干细胞正被用于肠道通透性模型31，32。犬类器官为人类类器官提供了相关的替代品，因为人类干细胞研究受到伦理问题的限制33.此外，犬类器官为探索犬类药物的通透性、代谢、活性转运和药物间相互作用提供了 一个体外 系统。为了解决这一技术差距，已经描述了犬肠类器官在可渗透支持系统中的持续和可靠生长34。与目前使用的测定相比，犬肠类器官的通透性测定可能潜在地预测犬肠通透性和小药物分子的代谢（Caco-2）。这些关键特征的确认使这种新颖 的体外 系统能够用于探索诱导剂对细胞内代谢和活性转运的潜在影响的工作。
犬类器官由通常存在于肠上皮层中的所有细胞类型组成。从功能和显微解剖学的角度来看，它们可靠地复制了犬类肠道上皮层的环境19，35。此外，犬肠类器官中粘液，犬类特异性药物转运蛋白和酶的存在以及整体细胞分化与狗体内看到的相当34。因此，类器官可以从患病的兽医患者中分离出来并用于模拟各种疾病过程（例如，慢性肠道炎症）对犬类口服药物通透性的影响19，36。犬肠类器官系统也可用于药物通透性实验以外的其他环境。这些3D结构也可以从先前由Chandra等人描述的用于炎症性肠病，结直肠腺癌和胃肠道间质瘤19的患病患者中分离出来。
渗透性支持播种方案描述了在插入物中建立犬肠类器官培养物的方法。第一个方案概述了分离接种在细胞外膜基质中的已建立的犬类器官培养物的方法。此外，本方案还讨论了插入片段与胶原I和细胞外膜基质的预涂层。还详细介绍了在可渗透支撑插入物中嵌入犬类器官。
第二个协议是单层维护协议，其中包括对镀在嵌件中的犬类3D类器官的一般维护。用于刷新培养物的类器官培养基的频率和体积，以及防止细胞培养损伤的方法，以及用于评估上皮单层汇合度的实验方法， 在第二个方案中提出。
最后，渗透率实验方案侧重于确定渗透性测定中的犬肠3D类器官是否已准备好进行实验使用的方法，以及在进行任何实验之前所需的验证步骤。本节还描述了渗透性实验的设置和成功执行，以及在单层培养物的腔室中孵育和取样治疗药物候选药物。还讨论了使用低渗透性荧光素异硫氰酸酯（FITC-葡聚糖）来监测单层完整性。最后，描述了一 种在 实验结束后验证结果的体外评价方法。渗透率实验是一个极其广泛的话题，Hubatsch等人很好地总结了这一点。 图 2 总结了协议的工作流程。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> 图1：可渗透支持系统上的犬肠类器官。 渗透性支撑插入物位于24孔板的孔中。微孔膜允许解离的犬肠类器官的接种，这些细胞最终将形成类器官2D单层。该技术允许访问单层的 AP 和 BL 侧。类器官介质被引入到可渗透支撑的AP室和BL室中。图示了候选药物的吸收（AP→BL→BL）和分泌（BL→AP），以及两种可能的药物运输方式。缩写： AP = 顶端;BL = 基底外侧。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> 图2：犬类类器官渗透性支持方案的工作流程。 将渗透性支撑插入物预涂有细胞外膜基质和胶原I的混合物，并孵育1小时。在孵育过程中，类器官培养物被解离。将单个类器官细胞接种在插入物中，接种后立即加入基底外侧室中的培养基，而在接种过程结束后24小时将培养基加入到顶端室中。类器官的维护和监测包括定期更换培养基、TEER值测量和光学显微镜检查，以评估单层的完整性。在实验之前，必须通过从培养基中除去ROCK抑制剂和GSKiβ来区分类器官。在实验当天测量TEER值，并通过光学显微镜检查类器官单层对细胞的损伤。然后将培养基更换为合适的缓冲液并在实验前孵育。FITC-葡聚糖测定在肠道通透性实验39 期间用作单层完整性的标志物。实验后进行TEER测量，光学显微镜将在24小时后验证结果。缩写：TEER =跨上皮电阻;岩石 = 罗氏相关激酶;GSKiβ = 糖原合酶激酶β;F = 荧光。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS (trimethoprim sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>170080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CM-Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>68059-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Permeable Support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS (Probes)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Flexible Laboratory Film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system

渗透性支持系统通常与传统的二维（2D）细胞系结合使用，作为评估新治疗候选药物的口服渗透性的 体外 工具。然而，使用这些常规细胞系有局限性，例如紧密连接的表达改变，部分细胞分化以及缺乏关键的核受体。尽管存在这些缺点，Caco-2和MDCK模型在预测人体内口腔通透性 方面 被广泛接受和验证。
狗是生物医学研究的相关转化模型，因为它们在胃肠道解剖学和肠道菌群与人类相似。因此，为了支持平行药物开发，非常需要制定一种有效而准确的 体外 工具来预测狗和人类的 体内 药物渗透性特征。这种工具可以是犬肠类器官系统，其特征在于来自成体干细胞的三维（3D），自组装的上皮结构。
（1）渗透性支持播种方案描述了在插入片段中解离和播种犬类器官的实验方法。犬类器官分离、培养和收获之前在本期特刊的一组单独的实验方案中已有描述。犬肠类器官单层的一般维护方法在（2）单层维护方案中进行了彻底讨论。此外，该协议描述了通过跨上皮电阻（TEER）测量和光学显微镜评估单层结构完整性的方法。最后，（3）渗透性实验方案描述了直接在实验之前的任务，包括实验结果的 体外 验证。
总体而言，犬类器官模型与双室细胞培养技术相结合，克服了与2D实验模型相关的局限性，从而提高了对犬类和人类患者候选治疗药物的表观口服通透性预测的可靠性。

犬类器官培养的标准操作程序在33中已有描述，本期特刊38也详细讨论了犬类器官方案。在可渗透的支撑物上培养的犬肠类器官被固定并嵌入石蜡，以检查单层和细胞群的显微解剖。石蜡包埋过程之前由Gabriel等人讨论过。已经进行了常规染色（苏木精和曙红），并且使用Alcian Blue染色技术来检测犬类器官单层中的高脚杯细胞（见 图7）。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> 图7：犬肠类器官单层染色。 渗透性支撑物中结肠来源的犬肠类器官已被石蜡包埋并用H&E和AB染色，使用光学显微镜在40x（A）和60x（B）放大率下拍摄代表性图像。H&E染色显示柱状上皮单层，并且在60x放大下可以观察到细胞顶端部分的微绒毛。AB染色进一步揭示了犬肠类器官单层中高脚杯细胞（深蓝色）的存在。比例尺 = 20 微米 （A）， 50 微米 （B）。缩写：H&E = 苏木精和曙红;AB = 阿尔西安蓝。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
渗透性支撑物上的类器官培养物应生长 10 至 14 天，以便为渗透性实验做好准备。光学显微镜与TEER值测量结合使用，以确认类器官培养物是否准备好进行候选药物的渗透性测试。图 8显示了来自健康和患病动物的不同犬肠类器官单层的代表性光学显微镜图像。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> 图8：犬肠类器官单层显微镜检查。 在光学显微镜下看到的生长单层图像。来自健康供体的类器官单层由空肠类（10x; 40x）和结肠样（20x; 40x）培养物代表。患病供体的类器官单层由十二指肠（5x; 10x）和回肠（5x; 10x）类肠组成，这些肠类来自诊断为PLE的犬类患者。两种PLE类器官培养物都是在类器官接种过程中细胞分离不当的例子，并且由于存在3D类器官，这些培养物不能用于药物渗透性测定。偏离正确单层形成的例子，如单层撕裂（5x），是由对生物样品的粗心操作引起的。类器官的长期培养（10x; 20x）是由于当类器官开始类似于其原始3D结构时，类器官在插入物上长时间保持。为了进行比较，给出了通常用于药物渗透性研究的渗透性载体上的传统2D细胞系的图像（MDCK-10x; 40x和Caco-2-10x; 20x）。缩写：PLE =蛋白质丢失肠病;MDCK = 马丁-达比犬肾。比例尺 = 500 微米 （5x）、200 μm （10x）、100 μm （20x）、50 μm （40x）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
类器官单层也固定在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的3%多聚甲醛-3%戊二醛中。透射电子显微镜（TEM）用于表征渗透载体上类器官培养物的超微结构。微绒毛和紧密连接的微解剖结构如图9所示。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> 图9：健康犬肠类器官单层的TEM图像。 TEM用于揭示空肠（A），回肠（B）和结肠（C）类器官单层的细胞微结构。渗透性支撑嵌件的微孔膜用黄色箭头标记。微绒毛（蓝色箭头）和紧密连接（红色箭头）的存在在图像中描绘出来。简称：TEM = 透射电子显微镜。比例尺 = 5 微米 （A）， 2 微米 （B， C）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
应同时进行TEER测量和光学显微镜检查，以确保系统已准备好进行渗透性测试。当TEER达到稳定状态时，该测定即可使用，而光学显微镜将有助于排除类器官的损伤或过度生长。 图6总结了由犬空肠肠和结肠样动物组成的五组的典型TEER测量结果。
表1：类器官介质和FAA的组成。 本表总结了《中国移动金融地理环境框架+》、《商品清单+反贪污假单》和《联邦航空局》的完整组成。缩写：ROCK = rho相关激酶;GSKiβ = 糖原合酶激酶β;CMGF + R / G =具有用岩石抑制剂和GSKiβ增强的生长因子的完全培养基;CMGF+ = 具有生长因子但不含岩石抑制剂或GSKiβ的完全培养基;FAA = 福尔马林 -乙酸-酒精;EGF =表皮生长因子。此表改编自 38。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>
补充表1：犬类器官渗透性支撑系统笔记表。 缩写：TEER =跨上皮电阻;岩石 = 罗氏相关激酶;GSKiβ = 糖原合酶激酶β;CMGF + R / G =具有用岩石抑制剂和GSKiβ增强的生长因子的完全培养基;CMGF+ = 具有生长因子但不含岩石抑制剂或GSKiβ的完整培养基。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>

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Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

在这里，我们提出了一个方案，描述了犬肠类器官在双室，可渗透的支持系统中的培养。描述了渗透性支撑物中的类器官接种、单层维持以及随后的药物渗透性实验。

双室渗透支持系统中的犬肠类器官

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

The combination of canine organoid technology and a dual chamber permeable support system overcomes the limitations of experimental 2D cell lines traditionally used in biomedical research models.The technology can increase the reliability of predictions of the apparent oral permeability of therapeutic drug candidates both in canine and human patients.The system can be applied to other fields of biomedical research including microbiology research, viral uptake studies, drug-drug interactions, and drug transport mechanisms.The standardization, detailed documentation of experimental procedures and consistent monitoring of the cell monolayers are crucial practices needed for the permeable support assays.Place the extracellular membrane matrix on ice to begin thawing.Submerge it in ice to protect against rapid thawing and avoid solidification.Pre-chill a refrigerated centrifuge to 4

canine-intestinal-organoids-in-a-dual-chamber-permeable-support-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.2K 次观看.  Iowa State University. The combination of canine organoid technology and a dual chamber permeable support system overcomes the limitations of experimental 2D cell lines traditionally used in biomedical research models.The technology can increase the reliability of predictions of the apparent oral permeability of therapeutic drug candidates both in canine and human patients.The system can be applied to other fields of biomedical research including microbiology research, viral uptake studies, drug-drug interactions, ...

视频: Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

一个负选择标记的发展阿米巴</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

科研

免疫与感染

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

培养小胶质细胞的新生和成年的中枢神经系统

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

该<em&gt;离体</em&gt;文化与模式识别小鼠肠道组织体受体刺激

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

基于插入渗透膜感染系统的实现研究分泌细菌病毒对哺乳动物宿主细胞的作用

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

一个简单的荧光试验犬中性粒细胞胞外陷阱里放的量化

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

哺乳动物细胞细菌挑战后应激颗粒形成的免疫荧光分析

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

诱导麻痹及视觉系统损伤小鼠 T 细胞特异的视神经脊髓炎抗原水通道蛋白-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

小鼠小肠免疫系统淋巴细胞的分离

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

体外犬中性粒细胞胞外陷阱的形成: 荧光显微镜动态定量分析

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

人类舱内单聚物研究病原体、共脉和宿主肠道上皮细胞之间的相互作用

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...