Iowa Eyalet Üniversitesi çalışanlarının Veteriner Teşhis Laboratuvarı'na, yani Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green ve Jennifer Groeltz-Pamukçuk'a, numunelerin zamanında işlenmesi için şükranlarımızı sunmak istiyoruz. Ayrıca Jodi Smith ve Bethann Valentine'e geçirgenlik deneyleri için malzeme sağladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca David Diaz-Regannon'a Şekil 9 ile ilgili yardımları için teşekkür etmek istiyoruz. Şekil 6 hariç, tüm rakamlar BioRender.com olarak oluşturulmuştur. Yazarlar, Fakülte Başlangıcı, ISU VPR Miller Ödülü, ISU VPR Miller Ödülü ve ISU # 1912948'ye NSF SBIR alt ödülünün desteğini kabul etmek istiyor.

K. Allensach, LifEngine Hayvan Sağlığı ve 3D Sağlık Çözümleri'nin kurucu ortağıdır. Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics ve Mars için danışman olarak hizmet vermektedir. J.P. Mochel, LifEngine Animal Health ve 3D Health Solutions'ın kurucu ortaklarından biridir ve Ceva Animal Health ve Ethos Animal Health için danışman olarak hizmet vermektedir. Bu makale yazarların görüşlerini yansıtmaktadır ve Gıda ve İlaç İdaresi'nin onayını, görüşünü veya politikalarını temsil edecek şekilde yorumlanmamalıdır. Diğer yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Geçirgen destek cihazındaki köpek bağırsak organoid kültürleri, geleneksel ilaç geçirgenlik tahlilleri40'ı yeni bir in vitro köpek modeli41 ile birleştiren benzersiz bir kavramdır. Farklı köpek bağırsak organoidleri türleri, minimum ayarlamalarla deneyin amacına göre kullanılabilir ve değerlendirilebilir. İlgilenilen ilacın çoklu konsantrasyonlarının grup başına 3-4 kuyuda test edilmesi önerilir. Konsantrasyonlar, ilacın beklenen bağırsak konsantrasyonuna dayanabilir. Ayrıca, önceki araştırmaları kullanmak, çalışma tasarımı için uygun zaman noktalarının belirlenmesine yardımcı olabilir. Tekrarlanabilirliği artırmak ve sorun gidermeye yardımcı olmak için çalışma tasarımının uygun dokümantasyonu yapılmalıdır.
Bu teknolojinin, yöntem42'nin yeniliği nedeniyle, çoğunlukla deneysel tasarımda standardizasyon eksikliği ve protokolün laboratuvarlar arasında yürütülmesi nedeniyle çeşitli sınırlamaları vardır. Bu standardizasyon eksikliği diğer grup43 tarafından kabul edilmiştir ve Köpek 3D Organoid Tek Katmanlı Protokolleri laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliğe yol açacak ve bu sisteme standardizasyon getirecektir. Veri analizine standartlaştırılmış yaklaşımlar tekrarlanabilirliği artırır ve farklı laboratuvarlarda geçirgen destek sistemindeki köpek organoidlerini kullanarak ön uyuşturucu testinin sonuçlarını güçlendirebilir. Köpek 3D organoid modeli ayrıca, model ilaçların in vitro Puygulama değerlerini, Caco-2 hücreleri44,45,46 gibi, bilinen insan veya köpek in vivo bağırsak emilimiyle karşılaştıran veri setlerinden yoksundur. Bu tür veriler üretildikten sonra, bu köpek organoid modeli, ilaç geliştirme sırasında bağırsak geçirgenliğini değerlendirmek için kullanılabilir.
Organoidleri geçirgen destek sistemine tohumlarken, uygun şekilde ayrışmış hücrelerin yeterince yüksek bir yoğunluğunu tohumlamak için dikkatli olunması çok önemlidir. Sistemin TEER değerleri, katı monokatmanlar halinde yetiştirildiğinde daha güvenilir ve tekrarlanabilir. Tek katmanların uzun süreli kültürü, TEER değerlerinde bağırsağın fizyolojik değerlerinden daha uzağa ulaşan üstel bir artışa yol açabilir. Bu tür 3D yapıların H & E bölümleri daha sonra zara daha yakın enterositlerin değiştirilmiş yapıları ile birbirlerinin üzerinde birkaç hücre katmanı gösterir.
Köpek bağırsak organoid monokatmanının başarılı bir şekilde genişlemesinden sonra, sonuçlar bir ilacın görünür geçirgenlik katsayısı (Puygulaması) formülü44 hesaplanarak geleneksel 2D hücre tahlilleriyle aynı şekilde analiz edilebilir. Puygulaması değeri (bkz. Eq (2)), hücresel tek katmanlı47 boyunca taşıma hızını tanımlar.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Bu <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> , konsantrasyonun zaman eğrisine karşı başlangıç eğimidir (örneğin, nmol / s). A , kesici ucun alanıdır (cm2) ve C0 , donör odasındaki ilacın veya bileşiğin başlangıç konsantrasyonudur37. Tek katmanlı bütünlüğün güvenilir bir şekilde tanınması, standardizasyon gerektiren geçirgenlik testinin çok önemli bir parçasıdır. Geçirgen bir destek sistemindeki köpek organoidlerini değerlendirmek ve deneyin doğru zamanlamasını belirlemeye yardımcı olmak için ışık mikroskobu ve TEER ölçümleri önerilir. Ek olarak, sıfır moleküler geçirgenlik belirteçleri (örneğin, FITC-dextran, Lucifer sarısı, PEG-400) organoid tek katmanlı bütünlüğü fonksiyonel olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Test edilen bileşiğin bir taşıyıcıdan etkilenmesi durumunda dikkat edilmelidir. P-glikoprotein (P-gp) yaygın bir efflux pompası örneği olarak kullanılır. İyi bilinen bir P-gp prob substratı ile karşılaştırıldığında bir efflux oranı (Puygulaması, BL-AP / Puygulaması, AP-BL) oluşturulmalıdır.
Işık mikroskobu (düz veya faz kontrastı ile güçlendirilmiş), olası hücresel aşırı büyümeyi değerlendirirken 2D veya 3D tek katmanın ve filtre ekinin bütünlüğünü kontrol etmek için paha biçilmez bir yöntemdir. Şekil 7 , sağlıklı köpek bağırsak organoid hücre kültürlerini tanımak için bir rehber görevi görebilir. TEER değerleri, hücreler arası bileşkelerin oluşumunun ve organoid kültürlerin sağlam bir bağırsak epiteline farklılaşmasının önemli bir ölçüsüdür. Köpek bağırsak organoidleri enterositlere ve kadeh hücrelerine farklılaşır (Şekil 6). Bu mukus üreten hücreler, geleneksel 2D hücre kültürleri kullanılarak elde edilmesi zor olan ilaç-mukus etkileşimlerinin incelenmesine izin verir48. Enteroendokrin hücrelerin varlığı daha önce Chandra ve ark.33 tarafından köpek bağırsak organoidlerinde doğrulanmıştır.
TEM kullanılarak jejunal, ileal ve kolonik organoidlerden türetilen köpek organoid monokatmanlarının daha fazla karakterizasyonu sağlanmaktadır. TEM görüntüleri, sıkı kavşaklar ve mikrovillus oluşumu da dahil olmak üzere hücresel mikromimariyi göstererek, bu organoid modellerin translasyonel tıptaki karmaşıklığını ve kullanışlılığını daha da göstermektedir. Deney sonuçlarına dayanarak, geçirgen destek üzerindeki organoid kültürler, tohumlama sonrası 11. ve 13. günler arasında deneye hazırdı (Şekil 9). Bu zaman noktasındaki TEER değerleri 1.500 ila 2.500Ω.cm2 arasında değişmiştir. TEER değerlerinin plato aşaması, TEER değerleri yavaş yavaş düşmeye başlamadan önce deneyin başlatılması gereken çok sınırlı bir zaman dilimi boyunca sürer. TEER değerleri, bazı ilaçlar veya ilaç ürünü eksipiyanları tek katmanla (örneğin, sıkı bağlantılar) etkileşime girebileceğinden, TEER değer okumalarını büyük ölçüde etkileyebileceğinden, önemli deneysel sonuçların gösterilmesinin önemli bir parçası olabilir. Bu tek başına bir deneme için veri görevi görebilir.
Çift odacıklı bir hücre kültürü aparatındaki köpek bağırsak organoidleri, ortaya çıkan hücre tek katmanının benzersiz mimarisi nedeniyle oral ilaç geçirgenliği dışındaki alanlarda uygulanabilir. Örneğin, mikrobiyoloji araştırmalarında (örneğin, GI mikrobiyal florasını değiştirmenin etkisi), viral alım çalışmalarında, ilaç-ilaç etkileşimlerinde ve ilaç taşıma mekanizmalarında kullanılabilirler49. Donör odası tipik olarak test ilacı veya tercih edilen bileşik ile doldurulur ve alıcı odasından alikotlar çeşitli zaman noktalarında alınır. Bu alikotlar, yüksek performanslı sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisi, enzime bağlı immünosorbent testi veya çözünenin tek katmana nüfuz ettiği miktarı ve hızı belirlemek için diğer teknikler kullanılarak analiz edilebilir.
Bu çalışmalar, ilaç geçirgenliğini doğru bir şekilde değerlendirmek için sağlam bir tek katman gerektirir. Bu tipik olarak, kullanılamaz kuyuları hesaba katmak için gerekli olanlardan daha fazla monokatman yetiştirmeyi gerektirir. Organoid hücre monokatmanları, bir monokatmanın apikal veya bazal tarafından viral alımı ölçmek için de kullanılabilir; virüsün hücresel alımını tespit etmek için immünofloresan tahlilleri kullanan antikorları içeren okumalar da kullanılabilir. Son olarak, taşıyıcı bazlı ilaç-ilaç etkileşimlerini tanımlamak için donör odasına birden fazla ilaç (yani, substrat ve inhibitör) uygulanabilir.
Mevcut gözlemlere dayanarak, bu yöntemler sadece kültür eklerindeki köpek organoidlerine uygulanmakla kalmayacak, aynı zamanda diğer veteriner türleri ve organ sistemleri için de uygun olacak ve tercih edilen türlere veya organ modeline en uygun şekilde uyacak küçük değişiklikler yapılacaktır. Köpek bağırsak organoid büyümesi için protokoller, kültürün benzersiz özelliklerine göre ayarlanmalıdır. Böylece, protokol başka bir türe göre ayarlanabilir, ancak protokolde ince değişiklikler gerektirecektir. Modifikasyonlar, hücre tohumlama yoğunluğundaki değişikliklerle başlayabilir ve ilgilenilen organoidleri düzgün bir şekilde ayırt etmek için ortam bileşimindeki değişikliklere genişleyebilir.
Standardizasyon, deneysel prosedürlerin ayrıntılı dokümantasyonu ve hücre monokatmanlarının tutarlı bir şekilde izlenmesi, geçirgen destek tahlillerinde ihtiyaç duyulan çok önemli uygulamalardır ve köpek sistemi ile sınırlı değildir. Bu olası türler veya organ modifikasyonları, alandaki daha ileri ilerlemeler için belgelemek ve raporlamak için kritik öneme sahiptir. Bu modelin, örneğin maliyet gereksinimleri, laboratuvarlar arası değişkenliği ve bağırsak emilimini in vivo olarak tahmin etme yeteneği hakkında sınırlı veriler gibi çeşitli sınırlamaları vardır. Köpekler, bazı durumlarda, insanlardan farklı ilaç taşıyıcılarına ve metabolize edici enzimlere sahiptir50.
Ayrıca, köpek organoid sistemi, böyle bir modelin uygunluğunu belirlemek için diğer üreticilerin çeşitli çift odacıklı aparatları üzerinde test edilmelidir (örneğin, farklı filtre membranı bileşimlerinin uygunluğu belirlenmelidir). Diğer bir dezavantaj, makalenin ilaç geçirgenliği deneyi bölümünün önceki bölümlere göre daha az açıklayıcı olmasıdır. Bu, bu alandaki aşırı bilgiden kaynaklanmaktadır. Makalenin bu bölümünün amacı, bu deneylerin temel taşlarının kenarlarını kesmeden, bu yöntemleri değiştirilebilir bir şekilde tanımlamaktı. Geçirgenlik deneyleri hakkında daha ayrıntılı bilgi Hubatsch ve ark.37 tarafından toplanmıştır. Ek olarak, geçirgen ekler kokültür, hücre göçü ve invazyon testi deneylerinde kullanılabilir4.
Sonuç olarak, çift odacıklı kültür cihazlarındaki köpek bağırsak organoidleri, biyomedikal alanlar ve translasyonel tıp da dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalarda kullanılma potansiyeline sahiptir. Protokoller, bir deneyi planlamak ve biyoloji alanındaki organoid modeller için laboratuvarlar arası veri güvenilirliğini teşvik etmek için çeşitli stratejiler oluşturur.

Geçirgen destek sistemleri tipik olarak terapötik ilaç adaylarının bağırsak epitel bariyeri 1,2 yoluyla görünür geçirgenliğini belirlemek için kullanılır. Ayrıca hücresel sekresyon3, hücre göçü4 ve ilaç toksisitesi5'i değerlendirmek için de kullanılabilirler. In vitro oral ilaç geçirgenlik testleri, ilaç keşif ve geliştirme süreci2'de önemli bir adımdır ve bireysel ilaç adayları ilaç Ar-Ge yaşam döngüsünün erken aşamasında test edilmektedir6. Geçirgen destek sistemi, çok kuyulu bir plakaya yerleştirilmiş yarı gözenekli bir zara sahip bir uçtan oluşan çift odacıklı bir hücre kültürü aparatıdır. Bu sistem, kesici uç7'de yetiştirilen bir hücre monokatmanının apikal ve bazolateral taraflarına doğrudan erişim sağlar. Bu sistemlerde kullanılan tek katmanlı tipik olarak gastrointestinal epitel hücrelerinden (örneğin, insan kolorektal adenokarsinomu Kako-2 hücre hattı)8 türetilir. Hücre kültürleri, bağırsak epitel hücrelerinin doğal mikromimarisini taklit eden polarize bir durumda büyür ve daha fazla hücresel farklılaşma, benzer mikroanatomi ve işlev7'yi mümkün kılar. Geçirgen destek ekinin ayrıntıları Şekil 1'de bulunabilir. Geleneksel olarak bağırsak ilaç geçirgenliğini değerlendirmek için kullanılan 2D hücre kültürlerine sahip eklerin tohumlanması, nispeten uygun fiyatlı ve kültür9'a kolaydır. Bu sistemler, terapötik ilaç adaylarının bağırsak metabolizmasını tahmin etme kapasitelerinin sınırlı olması da dahil olmak üzere birkaç önemli sınırlama sunar10,11. Bu, epitel hücreleri arasındaki sıkı kavşaklardan pasif emilim, efflux yoluyla aktif transepitelyal absorpsiyon veya alım taşıyıcıları (örneğin, P-glikoprotein, monokarboksilat taşıyıcı 1) ve enterositler tarafından metabolize edilen ilaçlar gibi tüm ilaç emilim mekanizmaları için geçerlidir.
Köpekler insanlarla ortak bir ortamı ve diyeti paylaşırlar12. Köpek bağırsak anatomisi ve mikrobiyom bileşimi, son 36.000 yılda evcilleştirmeye ve paylaşılan diyetlere atfedilen 13 insanlarınkine çok benzemektedir14. Ne yazık ki, bu benzerlikler hastalık gelişimi için yaygın nedenler / tetikleyiciler de olabilir. Köpekler, obezite 15, inflamatuar bağırsak hastalığı 16, kolorektal adenokarsinom17, gastrointestinal stromal tümör (GİST)18 ve göreceli uzun ömürlülükleri 19 ile ilişkili diğer çeşitli patolojiler gibi insanlara benzer kronik morbiditeler geliştirir. Buna göre, köpek organoidleri, Tek Sağlık Girişimi20'nin ruhuna uygun olarak bu kronik multifaktöriyel hastalıkların ters translasyonel araştırması için başarıyla kullanılabilir.
Kako-2 hücreleri, ilaç oral absorpsiyon tahlilleri21 için en çok kullanılan hücre hatlarıdır. Bu hücreler şu anda in vitro bağırsak geçirgenlik testleri2,22,23 için "altın standart" model olarak kabul edilmektedir. Caco-2 hücre hattı, insan bağırsak sisteminde bulunan efflux ve alım taşıyıcılarını ifade eder, ancak farklı ekspresyon seviyelerinde24,25,26. Kako-2 hücreleri ayrıca bir ilacın bağırsak efflux taşıyıcılarının bir substratı mı yoksa inhibitörü mü olduğunu belirlemek için model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır22,27. Caco-2 hücreleri kolonik kökenli olmasına rağmen, bir enterosit hücresini taklit ederler. Ne yazık ki, Caco-2 hücreleri, ince bağırsak9'un epitel tabakasından sadece bir hücre tipini temsil eder, bu da karmaşık bağırsak epitel hücre tipi bileşimini doğru bir şekilde özetleyemez. Örneğin, mukus üretimine adanmış kadeh hücreleri Kako-2 kültürlerinde yoktur, böylece mukus-ilaç etkileşimleri diğer hücre hatları28 ile kokültür olmadan değerlendirilemez. Ayrıca, Caco-2 kültürleri, gebelik X reseptörü (PXR), steroid X reseptörü (SXR) ve kurucu androstan reseptörü (CAR)29 gibi bağırsakta tipik olarak bulunan önemli nükleer reseptörlerin birkaçını ifade etmez. Sonuç olarak, Kako-2 kültürleri, bu reseptörlerin indükleyicileri olan bazı ilaçlar (örneğin, rifampin) tarafından ilaç taşıyıcılarının ve enzimlerinin indüksiyonunu modellemede başarısız olurlar30.
3D intestinal organoid teknolojisi bu sınırlamaların bazılarını ele alır19. Organoidler, mikroinvaziv teknikler kullanılarak toplanan doku örneklerinden oluşturulabilen yetişkin kök hücrelerden elde edilen kendiliğinden monte edilmiş yapılardır20. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler bağırsak geçirgenlik modelleri için kullanılmaktadır31,32. Köpek organoidleri, insan organoidlerine uygun bir alternatif sağlar, çünkü insan kök hücre araştırması etik konularla sınırlıdır33. Ayrıca, köpek organoidleri, köpek ilacı geçirgenliğini, metabolizmasını, aktif taşınmasını ve ilaç-ilaç etkileşimlerini keşfetmek için in vitro bir sistem sağlar. Bu teknoloji boşluğunu gidermek için, geçirgen bir destek sisteminde köpek bağırsak organoidlerinin tutarlı ve güvenilir büyümesi tanımlanmıştır34. Köpek bağırsak organoidleri ile yapılan bir geçirgenlik testi, şu anda kullanılan testlere (Caco-2) kıyasla köpek bağırsak geçirgenliğini ve küçük ilaç moleküllerinin metabolizmasını potansiyel olarak öngörebilir. Bu önemli özelliklerin doğrulanması, bu yeni in vitro sistemi, indükleyicilerin hücre içi metabolizma ve aktif taşıma üzerindeki potansiyel etkisini araştıran gelecekteki çalışmalara ödünç vermektedir.
Köpek organoidleri, tipik olarak bağırsağın epitel tabakasında bulunan tüm hücre tiplerinden oluşur. İşlevsel ve mikroanatomik bir bakış açısıyla, köpek bağırsağının epitel tabakasının ortamını güvenilir bir şekilde çoğaltırlar19,35. Ayrıca, mukus, köpeklere özgü ilaç taşıyıcıları ve enzimlerin varlığı ve köpek bağırsak organoidlerinde genel hücresel farklılaşma, köpeklerde in vivo olarak görülenlerle karşılaştırılabilir34. Böylece, organoidler hastalıklı veteriner hastalardan izole edilebilir ve çeşitli hastalık süreçlerinin (örneğin, kronik bağırsak iltihabı) köpek oral ilaç geçirgenliği üzerindeki etkisini modellemek için kullanılabilir19,36. Köpek bağırsak organoid sistemi, ilaç geçirgenlik deneylerinden başka ortamlarda da kullanılabilir. Bu 3D yapılar, Chandra ve ark. tarafından daha önce tanımlandığı gibi hastalıklı hastalardan izole edilebilir. inflamatuar bağırsak hastalığı, kolorektal adenokarsinom ve gastrointestinal stromal tümör19.
Geçirgen Destek Tohumlama Protokolü, eklerde köpek bağırsak organoid kültürleri oluşturma yöntemlerini açıklar. Bu ilk protokol, hücre dışı membran matrisinde kaplanmış yerleşik köpek organoid kültürlerini ayrıştırma yöntemlerini özetlemektedir. Ayrıca, eklerin kollajen I ve hücre dışı membran matrisi ile ön kaplaması bu protokolde tartışılmıştır. Köpek organoidlerinin geçirgen destek uçlarına gömülmesi de ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
İkinci protokol, bir kesici uçta kaplanmış köpek 3D organoidlerinin genel bakımını içeren Tek Katmanlı Bakım Protokolüdür. Kültürü yenilemek için kullanılan organoid ortamın sıklığı ve hacimleri ve hücre kültürü hasarını önlemenin yolları, epitel tek katmanının akıcılığını değerlendirmek için deneysel yöntemlerle birlikte bu ikinci protokolde sunulmaktadır.
Son olarak, Geçirgenlik Deneysel Protokolü, bir geçirgenlik testindeki köpek bağırsak 3D organoidlerinin deneysel kullanıma hazır olup olmadığını ve herhangi bir deney yapmadan önce gerekli doğrulama adımlarını belirlemenin yollarına odaklanmaktadır. Bu bölüm ayrıca, tek katmanlı kültürün odalarında terapötik ilaç adaylarının inkübasyonu ve örneklemesi ile birlikte bir geçirgenlik deneyinin kurulumunu ve başarılı bir şekilde yürütülmesini açıklamaktadır. Tek katmanlı bütünlüğü izlemek için düşük geçirgenliğe sahip floresein izotiyosiyanatın (FITC-dextran) kullanımı da tartışılmaktadır. Son olarak, bir deneyin sonuçlanmasından sonra sonuçları doğrulamak için in vitro bir değerlendirme yöntemi açıklanmaktadır. Geçirgenlik deneyleri son derece geniş bir konudur ve Hubatsch ve ark.37 tarafından çok iyi özetlenmiştir. Protokollerin iş akışı Şekil 2'de özetlenmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> Şekil 1: Geçirgen bir destek sistemi üzerindeki köpek bağırsak organoidleri. Geçirgen destek kesici ucu, 24 delikli bir plakanın kuyuğuna yerleştirilmiştir. Mikro gözenekli membran, ayrışmış köpek bağırsak organoidlerinin tohumlanmasına izin verir ve bu hücreler sonunda bir organoid 2D tek katman oluşturur. Bu teknoloji, tek katmanın hem AP hem de BL taraflarına erişim sağlar. Organoid ortam, geçirgen desteğin hem AP hem de BL odalarına sokulur. İlaç adayının absorpsiyonu (AP→BL) ve sekresyonu (BL→AP) ve iki olası ilaç taşıma şekli gösterilmiştir. Kısaltmalar: AP = apikal; BL = bazolateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> Şekil 2: Köpek organoid geçirgen destek protokollerinin iş akışı. Geçirgen destek parçası, hücre dışı membran matrisi ve kollajen I karışımı ile önceden kaplanır ve 1 saat boyunca inkübe edilir. Kuluçka işlemi sırasında, organoid kültür ayrışır. Bireysel organoid hücreler ekte tohumlanır, bazolateral odadaki ortam tohumlamadan hemen sonra eklenirken, tohumlama işlemi tamamlandıktan 24 saat sonra apikal odaya orta eklenir. Organoidlerin bakımı ve izlenmesi, düzenli ortam değişikliklerini, TEER değer ölçümlerini ve tek katmanın bütünlüğünü değerlendirmek için ışık mikroskobunu içerir. Deneyden önce, organoidler ROCK inhibitörü ve GSKiβ'yi ortamdan çıkararak ayırt edilmelidir. TEER değerleri deney gününde ölçülür ve organoid tek katmanlı hücrelere zarar vermek için ışık mikroskobu ile incelenir. Ortam daha sonra uygun bir tampon ile değiştirilir ve deneyden önce inkübe edilir. FITC-dextran testi, bağırsak geçirgenlik deneyleri39 sırasında tek katmanlı bütünlüğün bir belirteci olarak kullanılır. TEER ölçümleri deneyden sonra alınır ve ışık mikroskobu 24 saat sonra sonuçları doğrular. Kısaltmalar: TEER = transepitelyal elektrik direnci; ROCK = rho ile ilişkili kinaz; GSKiβ = glikojen sentaz kinaz beta; F = floresan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS (trimethoprim sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>170080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CM-Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>68059-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Permeable Support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS (Probes)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Flexible Laboratory Film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system

Geçirgen destek sistemi tipik olarak geleneksel iki boyutlu (2D) hücre hatları ile birlikte, yeni terapötik ilaç adaylarının oral geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro bir araç olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu geleneksel hücre hatlarının kullanımı, sıkı bağlantıların değiştirilmiş ekspresyonu, kısmi hücre farklılaşması ve anahtar nükleer reseptörlerin yokluğu gibi sınırlamalara sahiptir. Bu eksikliklere rağmen, Caco-2 ve MDCK modelleri, insan in vivo oral geçirgenliğinin tahmini için yaygın olarak kabul edilmekte ve doğrulanmaktadır.
Köpekler, gastrointestinal anatomi ve bağırsak mikroflorasındaki insanlarla benzerlikleri nedeniyle biyomedikal araştırmalar için uygun bir translasyonel modeldir. Buna göre ve paralel ilaç geliştirmeyi desteklemek için, hem köpeklerde hem de insanlarda in vivo ilaç geçirgenlik özelliklerini tahmin etmek için etkili ve doğru bir in vitro aracın detaylandırılması oldukça arzu edilmektedir. Böyle bir araç, yetişkin kök hücrelerden türetilen üç boyutlu (3D), kendiliğinden monte edilmiş epitel yapıları ile karakterize edilen köpek bağırsak organoid sistemi olabilir.
(1) Geçirgen Destek Tohumlama Protokolü, eklerdeki köpek organoidlerinin ayrışması ve tohumlanması için deneysel yöntemleri açıklar. Köpek organoid izolasyonu, kültürü ve hasadı daha önce bu özel sayıda ayrı bir protokol setinde açıklanmıştır. Köpek bağırsak organoid monokatmanının genel bakımı için yöntemler (2) Tek Katmanlı Bakım Protokolü'nde ayrıntılı olarak tartışılmıştır. Ek olarak, bu protokol, transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümleri ve ışık mikroskobu yoluyla tek katmanın yapısal bütünlüğünü değerlendirmek için yöntemleri açıklamaktadır. Son olarak, (3) Geçirgenlik Deney Protokolü, deneysel sonuçların in vitro doğrulaması da dahil olmak üzere, bir deneyden hemen önceki görevleri tanımlar.
Genel olarak, köpek organoid modeli, çift odacıklı bir hücre kültürü teknolojisi ile birleştirildiğinde, 2D deneysel modellerle ilişkili sınırlamaların üstesinden gelir, böylece hem köpek hem de insan hastada terapötik ilaç adaylarının görünür oral geçirgenliğinin tahminlerinin güvenilirliğini arttırır.

Köpek organoidlerinin kültürü için standart çalışma prosedürleri daha önce tanımlanmıştır33 ve Köpek Organoid Protokolü de bu özel sayı38'de ayrıntılı olarak tartışılmıştır. Geçirgen destekler üzerinde kültürlenen köpek bağırsak organoidleri, tek katmanlı ve hücre popülasyonlarının mikroanatomisini incelemek için sabitlenmiş ve parafin gömülmüştür. Parafin gömme işlemi daha önce Gabriel ve ark.38 tarafından tartışılmıştır. Rutin boyama (hematoksilin ve eozin) uygulanmış ve köpek organoid tek katmanındaki kadeh hücrelerini tespit etmek için Alcian Blue boyama tekniği kullanılmıştır (bkz. Şekil 7).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> Şekil 7: Köpek bağırsak organoid tek katmanlı boyama. Geçirgen destekteki kolonik kökenli köpek bağırsak organoidleri parafin gömülü ve H & E ve AB ile boyanmıştır. temsili görüntüler 40x (A) ve 60x (B) büyütmede ışık mikroskobu kullanılarak alınmıştır. H & E boyaması sütunlu bir epitel monokatmanı ortaya çıkarır ve hücrelerin apikal kısmındaki mikrovillus 60x büyütmede gözlemlenebilir. AB boyaması, köpek bağırsak organoid monokatmanında kadeh hücrelerinin (koyu mavi) varlığını daha da ortaya koymaktadır. Ölçek çubukları = 20 μm (A), 50 μm (B). Kısaltmalar: H & E = hematoksilin ve eozin; AB = Alcian Mavisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Geçirgenlik deneyi için hazır olması için geçirgen destek üzerindeki organoid kültürün 10 ila 14 gün boyunca yetiştirilmesi gerekir. Işık mikroskobu, ilaç adaylarının geçirgenlik testi için organoid kültürünün hazır olduğunu doğrulamak için TEER değer ölçümleri ile birlikte kullanılır. Sağlıklı ve hastalıklı hayvanlardan farklı köpek bağırsak organoid monokatmanlarının temsili ışık mikroskobik görüntüleri Şekil 8'de sunulmuştur.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> Şekil 8: Köpek bağırsak organoid tek katmanlı mikroskopi. Işık mikroskobu altında görüldüğü gibi büyüyen monokatmanların görüntüleri. Sağlıklı donörlerden elde edilen organoid monotabakalar jejunal enteroid (10x; 40x) ve kolonoid (20x; 40x) kültürleri ile temsil edilir. Hastalıklı donörlerin organoid monokatmanları, PLE tanısı alan bir köpek hastasından türetilen duodenal (5x; 10x) ve ileal (5x; 10x) enteroidlerle temsil edilir. Her iki PLE organoid kültürü de organoidlerin tohumlanması sırasında yanlış hücre izolasyonunun örnekleridir ve bu kültürler 3D organoidlerin varlığı nedeniyle ilaç geçirgenlik testleri için kullanılamaz. Tek katmanlı yırtılmalar (5x) gibi uygun tek katmanlı oluşumdan sapma örnekleri, biyolojik numunelerin dikkatsiz manipülasyonundan kaynaklanır. Uzun süreli organoid kültürü (10x; 20x), organoidler orijinal 3D yapılarına benzemeye başladığında kesici uç üzerindeki organoidlerin uzun süre korunmasından kaynaklanır. Karşılaştırma için, ilaç geçirgenliği çalışmaları için yaygın olarak kullanılan geçirgen destekler üzerindeki geleneksel 2D hücre çizgilerinin görüntüleri sunulmaktadır (MDCK-10x; 40x ve Caco-2-10x; 20x). Kısaltmalar: PLE = protein kaybeden enteropati; MDCK = Madin-Darby köpek böbreği. Ölçek çubukları = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Organoid monokatmanlar ayrıca fosfat tamponlu salinde (PBS) %3 Paraformaldehit-%3 Glutaraldehit ile sabitlendi. İletim elektron mikroskobu (TEM), geçirgen destekler üzerindeki organoid kültürün ultrayapısını karakterize etmek için kullanıldı. Mikrovillusların mikroanatomik yapıları ve sıkı kavşaklar Şekil 9'da görülebilir.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> Şekil 9: Sağlıklı köpek bağırsak organoid monokatmanlarının TEM görüntüleri. Jejunal (A), ileal (B) ve kolonik (C) organoid monolayerların hücresel mikromimarisini ortaya çıkarmak için TEM kullanıldı. Geçirgen destek ekinin mikro gözenekli zarı sarı bir okla işaretlenmiştir. Görüntülerde mikrovillus (mavi ok) ve sıkı kavşakların (kırmızı ok) varlığı belirtilmiştir. Kısaltma: TEM = İletim elektron mikroskobu. Ölçek çubukları = 5 μm (A), 2 μm (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Sistemin geçirgenlik testine hazır olduğundan emin olmak için hem TEER ölçümleri hem de ışık mikroskobu yapılmalıdır. Tahlil, TEER sabit bir duruma ulaştığında kullanıma hazırdır, ışık mikroskobu ise organoidlerin hasarını veya aşırı büyümesini dışlamaya yardımcı olacaktır. Köpek jejunal enteroidleri ve kolonoidlerden oluşan beş grubun tipik TEER ölçümlerinin bir özeti Şekil 6'da sunulmuştur.
Tablo 1: Organoid medya ve FAA bileşimi. CMGF+, CMGF+ R/G ve FAA'nın tam bileşimi bu tabloda özetlenmiştir. Kısaltmalar: ROCK = rho ile ilişkili kinaz; GSKiβ = glikojen sentaz kinaz beta; CMGF + R/G = ROCK inhibitörü ve GSKiβ ile geliştirilmiş büyüme faktörlerine sahip tam ortam; CMGF + = Büyüme faktörleri olan ancak ROCK inhibitörü veya GSKiβ içermeyen tam ortam; FAA = formalin-asetik asit-alkol; EGF = epidermal büyüme faktörü. Bu tablo 38'den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo 1: Geçirgen destek sistemi olan köpek organoidi üzerine not alma tablosu. Kısaltmalar: TEER = transepitelyal elektrik direnci; ROCK = rho ile ilişkili kinaz; GSKiβ = glikojen sentaz kinaz beta; CMGF + R/G = ROCK inhibitörü ve GSKiβ ile geliştirilmiş büyüme faktörlerine sahip tam ortam; CMGF + = Büyüme faktörleri olan ancak ROCK inhibitörü veya GSKiβ içermeyen tam ortam. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System at JoVE.com

Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Burada, çift odacıklı, geçirgen bir destek sisteminde köpek bağırsak organoidlerinin kültürünü tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Geçirgen desteklerde organoid tohumlama, tek katmanlı bakım ve ardından ilaç geçirgenliği deneyleri anlatılmaktadır.

Çift Odalı Geçirgen Destek Sisteminde Köpek Bağırsak Organoidleri

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

canine-intestinal-organoids-in-a-dual-chamber-permeable-support-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.3K Görüntüleme.  Iowa State University. Burada, çift odacıklı, geçirgen bir destek sisteminde köpek bağırsak organoidlerinin kültürünü tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Geçirgen desteklerde organoid tohumlama, tek katmanlı bakım ve ardından ilaç geçirgenliği deneyleri anlatılmaktadır.

Video: Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

Negatif Seçilebilir Marker Geliştirme Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Felç ve görsel sistem yaralanma tarafından Nöromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 T hücreleri belirli farelerde indüksiyon

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and maintained in culture, provides an exciting opportunity to facilitate the modeling of the epithelial response to enteric infections. In vivo, intestinal epithelial cells (IECs) play a key role in regulating intestinal homeostasis and may directly inhibit pathogens, although the mechanisms by which this occurs are not fully elucidated. The cytokine interleukin-22 (IL-22) has been shown to play a role in the maintenance and defense of the gut epithelial barrier, including inducing a release of antimicrobial peptides and chemokines in response to infection.
We describe the differentiation of healthy control hiPSCs into iHOs via the addition of specific cytokine combinations to their culture medium before embedding them into a basement membrane matrix-based prointestinal culture system. Once embedded, the iHOs are grown in media supplemented with Noggin, R-spondin-1, epidermal growth factor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, and Y-27632 dihydrochloride monohydrate. Weekly passages by manual disruption of the iHO ultrastructure lead to the formation of budded iHOs, with some exhibiting a crypt/villus structure. All iHOs demonstrate a differentiated epithelium consisting of goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells, and polarized enterocytes, which can be confirmed via immunostaining for specific markers of each cell subset, transmission electron microscopy (TEM), and quantitative PCR (qPCR). To model infection, Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 are microinjected into the lumen of the iHOs and incubated for 90 min at 37 &#176;C, and a modified gentamicin protection assay is performed to identify the levels of intracellular bacterial invasion. Some iHOs are also pretreated with recombinant human IL-22 (rhIL-22) prior to infection to establish whether this cytokine is protective against Salmonella infection.

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived intestinal organoids offer exciting opportunities to model enteric diseases in vitro. We demonstrate the differentiation of hiPSCs into intestinal organoids (iHOs), the stimulation of these iHOs with cytokines, and the microinjection of Salmonella Typhimurium into the iHO lumen, enabling the study of an epithelial invasion by this pathogen.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücresini kullanma- Salmonella ve diğer patojenlere karşı epitelyal hücre korumasını Incelemek ve değiştirmek Için bağırsak organoidleri türetilmiştir

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...